RSV qPCR Detection Kit-24rxn-PQ3661

راهنمای استفاده برای کیت تشخیص مولکولی RSV qPCR Detection Kit نام محصول: کیت تشخیص ویروس سینسیشیال تنفسی تایپ A و B در نمونه های سواپ حلق و بینی با شماره TaqMan Real-time PCR روش با PQ3661 کاتالوگ حیطه کاربرد: ویروس سینیسشیال تنفسی )RSV )از خانواده پنوموویریده و جنس ارتوپنوموویروس، پوشش دار با RNA تک رشته ای، قطر 200-150 nm و دارای تقارن مارپیچی می باشد. این ویروس در کودکان و افراد مسن می تواند باعث بیماری شدید و جدی مانند برونشیولیت ، پنومونی و حتی مرگ گردد. اصول انجام کار: در این کیت تشخیص ویروس سینیسشیال تنفسی )ژنوتایپ های B-A ( از طریق افزایش شدت فلورسنت ناشی از تکثیر قطعه ی 70 جفت بازی محافظت شده از ژنوم ویروس )ژن N )در کانال FAM و بصورت تک مرحله ای طراحی گردیده است. این کیت حاوی کنترل داخلی )P RNase )در کانال HEX بوده که به کمک آن می توان وجود عوامل مهار کننده ی واکنش PCR ، کارآیی واکنش و صحت فرآیند استخراج را ارزیابی کرد. محتویات کیت: مقدار اجزاء کیت برای 48 واکنش ردیف 480µl One Step RT qPCR Master Mix 1 100µl Primer&Probe Mix 3 45µl Positive Control 4 تجهیزات مورد نیاز: سمپلر و سرسمپلر فیلتر دار، دستگاه -Real PCR time دارای کانال های خوانش رنگ های سبز و زرد، کیت یا سیستم اتوماتیک استخراج اسید نوکلئیک، میکروتیوب های Real-time PCR واکنش مخصوص شرایط نگهداری نمونه ها: جمع آوری نمونه باید مطابق پروتکل های استاندارد صورت گیرد. انتقال نمونه بایستی حداکثر طی 24 ساعت در دمای 8-2 درجه سانتیگراد به آزمایشگاه منتقل شوند. در دمای زیر -20 درجه سانتی گراد نمونه تا چندین هفته پایدار بوده و تیتر ویروس در آن ثابت می ماند. حداقل نمونه ی مورد نیاز برای آزمایش100 میکرولیتر می باشد. نمونه های قابل قبول برای آزمون: نمونه های تنفسی فوقانی شامل غرغره گلو، سواب بینی-حلقی، نازوفارنکس و اوروفارنکس، ترشحات یا مایع حاصل از شست و شوی انتهای بینی و حلق، مایع حاصل از شست و شوی ریه ها )BAL (و ترشحات نای و خلط برای آزمون مورد تایید می باشد. حمل و نقل و شرایط نگهداری کیت: این محصول باید در دمای منفی 20 درجه حمل و نگهداری شود. کیت مذکور تا اتمام تاریخ انقضای درج شده بر روی جعبه ی آن قابلیت استفاده دارد. جهت جلوگیری از کاهش حساسیت تست از ذوب و انجماد مکرر محتویات کیت )بیش از 3 بار( خودداری گردد. دستگاه های PCR time-Real سازگار با محصول: این کیت قابلیت استفاده در تمامی دستگاه های دارای کانال های FAM و HEX را دارا می باشد. استخراج اسیدنوکلئیک: سنجش عملکرد کیت بستگی به میزان و کیفیت RNA استخراج شده دارد. استخراج RNA بایستی طبق پروتکل کیت های معتبر موجود در بازار انجام شود. برای فرآیند Viral RNA & DNA Extraction Kit (SinaClon- EX6065) استخراج دارای مجوز IVD از اداره کل تجهیزات پزشکی توصیه می شود. پروتکل آزمون تشخیصی PCR Time-Real:ویال های حاوی اجزای واکنش را روی رک یخ قرار دهید تا ذوب شوند و پس از اسپین ویال ها اقدام به آماده سازی مخلوط واکنش به صورت زیر نمایید: دقت نمایید که عالوه بر نمونه ها، 2 ویال برای کنترل مثبت و کنترل منفی آماده نمایید. NTC Positive Control Sample اجزاء 10 10 10 One Step RT qPCR Master Mix Primer&Probe Mix 2 2 2 8 – – Sample (RNA) – 5 – Positive Control NTC – – 8 انجام آزمایش PCR time-Real: میکروتیوب های آماده شده را در دستگاه PCR time-Real قرار دهید. کانال FAM را برای B-A RSV و کانال HEX را برای IC انتخاب نمایید و 2 طبق پروتکل زیر برنامه دمایی را اجرا نمایید. دمای C ° 62 برای خوانش رنگ های فلورسانس انتخاب می گردد. 1 cycle 20 min 50 ° C cDNA Synthesis 1 cycle 5 min 95 ° C PreDenaturation 40 cycles 20 s 95 ° C PCR cycles 30 s 62 ° C پیشنهاد: برای رسیدن به فاز Plateau در پیک نمونه هایی با کانت پایین تعداد سیکل را می توان به 45 افزایش داد. آنالیز نتایج کنترل مثبت: در مرحله اول، عملکرد کنترل مثبت را بررسی کنید. Ct منحنی کنترل مثبت بایستی کمتر از 35 )35>Ct )باشد. واکنش NTC: در شرایط ایده آل، نتیجه واکنش NTC، باید به صورت یک خط مسطح )نتیجه منفی( باشد که نشان دهنده عدم آلودگی مواد زمینه واکنش می باشد. منحنی تکثیر NTC در 38Ct، نتایج نامعتبر بوده و آزمون بایستی مجددا تکرار شود. کنترل داخلی IC: وجود منحنی تکثیر برای کنترل داخلی (IC)، نشان دهنده استخراج موفقیت آمیز RNA و نیز عملکرد مطلوب و کیفیت مواد بیولوژیکی واکنش می باشد. در صورتیکه نمونه تست دارای منحنی IC با مقدار 38>Ct باشد، استخراج RNA و انجام واکنش مورد تایید است. شناسایی کنترل داخلی (P RNase (برای نمونه های منفی بیمار ضروری بوده و نشاندهنده کیفیت مناسب نمونه میباشد ، در صورت مشاهده Ct باالتر از 38 که می تواند بدلیل غلظت پایین RNA و یا وجود ممانعت کننده در واکنش باشد، پیشنهاد میشود استخراج نمونه تکرار شود و یا نمونه گیری مجدد انجام گیرد. عدم شناسایی سیگنال کنترل داخلی در نمونه های مثبت با تیتر باالی ویروس می تواند مشاهده گردد که این امر میتواند منجر به کاهش یا عدم حضور سیگنال کنترل داخلی در نمونه های مثبت شود. نمونه مورد آزمون: نمونه هایRSV مثبت، بایستی دارای منحنی ʺسیگموئیدیʺ با 38>Ct باشند. اگر نمونه مورد آزمون دارای منحنی تکثیر با مقدار 38Ct 38Ct مثبت معتبر منفی معتبر 38>Ct – تکرار تست نامعتبر 38<Ct – تکرار تست نامعتبر – – حساسیت تست: حداقل تعداد کپی قابل تشخیص در این تست 150 ml/Copy می باشد. اختصاصیت تست:کیت تشخیصی Detection qPCR RSV Kit شرکت سیناکلون )تهران کاوش کلون( برای توالی ژن هدف RSV به صورت اختصاصی طراحی شده است. این کیت در بررسی هیچ گونه واکنش متقاطعی با پاتوژن ها ی تنفسی رایج زیر ندارد. MERS Coronavirus ;Influenza A viruses (H3N2 and H1N1); influenza B virus; Human Coronaviruses OC43, 229E, NL63; HKU1; Human adenovirus; Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenza;Staphylococcus aureus