کیت الایزای Free T4

کیت سنجش T4 Free به روش الایزا
مقدمه :
هورمون تیروکسین (T4 (هورمون عمده و مهم تیروئید در خون می باشد و بوسیله پروتئینهاي حامل که اصلی ترین آنها TBG می باشد، انتقال می یابد. قسمت عمده T4
در خون متصل به پروتئینها بوده و تنها در حدود 3 0/0 درصد آن به شکل آزادمی باشد (T4 Free (و در واقع همین شکل آزاد است که داراي فعالیت بیولوژیک بوده و
روي سلولهاي هدف مؤثر است. مقدار کل تیروکسین در خون (T4 Total (بعنوان یک فاکتور مهم در بررسی وضعیت تیروئید مطرح می باشد اما به علت تغییر غلظت
پروتئینهاي حامل در مواردي مثل بارداري، مصرف قرصهاي ضد بارداري، استروژن درمانی و بیماریهاي مرتبط با تیروئید مقدار T4 Total نیز بطور کاذب دچار تغییر می
گردد و این در حالیست که تیروئید داراي عملکرد طبیعی می باشد. همچنین در بعضی موارد با وجود عملکرد غیر طبیعی تیروئید (هیپو تیروئیدیسم و هیپرتیروئیدیسم)
تغییرات بوجود آمده در غلظت TBG می تواند باعث ثبت نتایج نا درست در سنجش مقدار واقعی T4 Total شود. از این روي اندازه گیري غلظت T4 Free که غیر وابسته
به عوامل فوق می باشد وضعیت و عملکرد غدة تیروئید را بهتر نمایان می سازد و بعلاوه جایگزین بهتري بجاي FTI می باشد .
اساس آزمایش :
کیت T4 Free حاضر به روش رقابتی و به کمک آنتی بادي منوکلونال طراحی گردیده است. در این روش چاهکها توسط آنتی بادي منوکلونال که علیه مولکول T4
می باشد پوشش داده می شوند (Coating .(استانداردها و نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور شده و سپس محلول T4 کنژوگه با آنزیم
HRP به چاهکها اضافه می شوند که این T4 کنژوگه (HRP-T4 (با T4 آزاد نمونه ها در اتصال به آنتی بادیهاي کوت شده در چاهکها رقابت می کند، بنابراین هر چه
مقدار T4 Free در نمونه بیشتر باشد مقدار T4 کنژوگه کمتري به آنتی بادي هاي کوت شده متصل می گردد و بالعکس .پس از شستشو، محلول رنگزا که حاوي هیدروژن
پراکسید (H2O2 (و کروموژن است، داخل چاهکها ریخته شده که بعد از انکوباسیون رنگ آبی پدید آمده به صورت معکوس با غلظت T4 Free موجود در نمونه ها
متناسب است. براي جلوگیري از فعالیت بیش از اندازه و نامناسب آنزیم، محلول متوقف کننده افزوده می گردد که فعالیت آنزیم را مختل کرده و رنگ آبی را به زرد تبدیل
می نماید و بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1 (پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد T4) Plate Coated T4-Anti. (
2 (محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme T4 : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
استانداردها سایر و لیتر میلی 1 حاوي صفر استاندارد (8 ، 4 ، 2 ، 0/8 ، 0/2 ، 0 ng/dl T4 غلظتهاي شامل استاندارد ویال 6 : (Standards Set) استانداردها سري) 3
حاوي 5/0میلی لیتر می باشند) .
4 (سرم کنترل : یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5 (محلول (Buffer Assay : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6 (محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X 20 . ( جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف مقدار لازم از محلول شستشوي غلیظ را
به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق کنید .
7 (محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen : (یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
8 (محلول متوقف کننده (Solution Stop : (یک ویال حاوي 12 میلی لیتر .
9 (برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1 (دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر و در صورت امکان 630 نانومتر .
2 (سمپلر هاي 25 و50 و100 میکرولیتر دقیق .
3 (آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1 (محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2 (از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3 (کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت احتیاط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
تھران، شھرک گلستان، بلوار گلھا، خیابان یاس سوم، نبش خیابان یاسمن، پلاک ١ ،کد پستی ١٤٩٤٧٣٤٤٦٣
تلفن ٤٢١٩٧٠٠٠ فکس ٤٢١٩٧٠٠٧
sms 300071402 www.pishtazteb.com info@pishtazteb.com
ویرایش چھارم – اردیبھشت ٩٢
2
شرایط نگهداري :
1 (کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2 (چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3 (پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاء نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4 (محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(حداکثر تا 30 روز) در دماي 20 -درجه سانتی گراد نگهداري نمود. در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1 (قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق رسانده و بخوبی تکان دهید تا کاملاً یکنواخت شوند .
2 (بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3 (از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4 (پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5 (براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6 (از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7 (به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1 (تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2 (25 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین معنی
که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید، سپس50 میکرولیتر اسی بافر و در پی آن50
میکرولیتر آنزیم کنژوگه را داخل چاهک ها ریخته و براي مدت 15 ثانیه پلیت را تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و آنگاه درب چاهکها را با برچسب
مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 1 ساعت در درجه حرارت اتاق (28 -22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
3 (چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک
چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته
و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر
بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
4 (100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید و چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید
5 (با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري هر چاهک
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
1 (جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2 (با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی بدست آید

3 (میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی خط عمودي بر محور افقی وارد کنید، نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال T4 Free درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال
خود را بدست آورد :
ng/dl واحد برحسب طبیعی محدوده 0/7-1/8
شاخصهاي اجرایی :
1 (حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت T4 Free قابل تشخیص در این کیت dl/ng 1/0 می باشد .
2 (دقت آزمایش :
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف T4 Free انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است : آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در سري آزمایش هاي
جدول شماره 1) اینترا- اسی) :
CV
میانگین SD(%)
نمونه تعداد دفعات تکرار تست (dl/ng(
6 0/03 0/5 24 1
3/3 0/05 1/5 24 2
3/5 0/26 7/4 24 3
جدول شماره 2) اینتر- اسی) :
CV
میانگین SD(%)
نمونه تعداد دفعات تکرار تست (dl/ng(
7/1 0/04 0/56 10 1
3/9 0/06 1/55 10 2
4/6 0/35 7/67 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
استانداردها
جذب نوري (dl/ng(
0 2/20
0/2 1/80
0/8 1/00
2 0/30
4 0/055
8 0/023

مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال T4 Free درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال
خود را بدست آورد :
ng/dl واحد برحسب طبیعی محدوده 0/7-1/8
شاخصهاي اجرایی :
1 (حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت T4 Free قابل تشخیص در این کیت dl/ng 1/0 می باشد .
2 (دقت آزمایش :
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف T4 Free انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است : آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در سري آزمایش هاي
جدول شماره 1) اینترا- اسی) :
CV
میانگین SD(%)
نمونه تعداد دفعات تکرار تست (dl/ng(
6 0/03 0/5 24 1
3/3 0/05 1/5 24 2
3/5 0/26 7/4 24 3
جدول شماره 2) اینتر- اسی) :
CV
میانگین SD(%)
نمونه تعداد دفعات تکرار تست (dl/ng(
7/1 0/04 0/56 10 1
3/9 0/06 1/55 10 2
4/6 0/35 7/67 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .

3 (ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از T4 Free به 4 سرم با غلظتهاي مشخص T4 Free افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
ریکاوري
(%)
مقدار بدست آمده
(ng/dl)
مقدار مورد انتظار
(ng/dl)
مقدار افزوده شده T4 Free
(ng/dl)
مقدار T4 Free موجود در سرم
(ng/dl) نمونه
95 0/34 0/36 0/2 0/53 1
98 0/65 0/66 0/8 0/53 1
91 1/15 1/26 2 0/53 1
105 0/6 0/57 0/2 0/95 2
92 0/8 0/87 0/8 0/95 2
102 1/5 1/47 2 0/95 2
98 0/83 0/85 0/2 1/5 3
103 1/19 1/15 0/8 1/5 3
106 1/86 1/75 2 1/5 3
97 1/6 1/65 0/2 3/1 4
93 1/81 1/95 0/8 3/1 4
101 2/58 2/55 2 3/1 4
٤ (خطی بودن آزمایش :
شده است : به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 3 نمونه سرم با غظت مشخص از T4 Free تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
ریکاوري (%)
مقدار T4 Free موجود در سرم رقیق نشده
(ng/dl)
نمونه 1/16 رقت 1/8 رقت 1/4 رقت 1/2 رقت
98 102 103 107 7/8 1
107 99 101 95 6/5 2
104 91 109 92 3/4 3
٥ (اختصاصیت آزمایش:
3, 3’, 5 – ، 3, 3’, 5’ – Triiodothyronine (rT3) ، 3, 3’, 5 – Triiodothyronine (T3) مختلف غلظتهاي با سرمهایی کمک به آزمایش این اختصاصیت
شد بررسی Free T4 با متقاطع واکنشهاي بررسی جهت 3, 5 – Diiodothyronine و 3, 3’, 5 – Triiodothyropropionic acid – Triiodothyro acetic acid
که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
Free T4 ( ng/dl ) ظاهري غلظت ) nmol/L ) غلظت آنالیت
<0/1 1000 3, 5 – Diiodothyronine
<0/1 100 3, 3’, 5 – Triiodothyronine (T3)
<0/1 100 3, 3’, 5’ – Triiodothyronine (rT3)
<0/1 100 3, 3’, 5 – Triiodothyro acetic acid
<0/1 100 3, 3’, 5 – Triiodothyropropionic acid

References:
1-Tiet, N.W, Fundamentals of clinical chemistry, 2nd Ed, Pg, 602 saunders press, phila, 1976
2-Barker,S.B. – Determination of protein bound iodine journal biological chemistry, 173, 175, (1984)
3-young, D.S, pestaner, L.C and Gilberman, U young effects of drugs on clinical laboratory tests clincal chemistry, 21, 3660, (1975)
4-sati, c. , chattor, A.J. , Watts, N. in fundamentals of clinical chemistry. Ed, Tietz, N.W. 3rd Edition, pg. 586, saunders press
phila.1987
روش انجام آزمایش بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد T4 Free
سرم کنترل – 25 میکرولیتر – استانداردها 25 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 25 میکرولیتر
اسی بافر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند سپس دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت
بپوشانید . 60 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را
بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)قرائت کنید .