کیت الایزای HBs Ag

Ag HBs به روش الایزا
آنزیم ایمونواسی براي تشخیص آنتی ژن سطحی هپاتیت B) تنها براي استفاده در تشخیص آزمایشگاهی)
مقدمه :
عفونت هپاتیت B به عنوان یک مشکل بهداشتی در تمام جهان شناخته شده است . عامل بیماري ویروس هپاتیت B از خانواده هپادنا ویریده بوده که داراي ژنوم DNA نیمه دو
رشته اي و حلقوي می باشد. این ویروس داراي 8 ژنوتیپ بوده و 9 تیپ سرولوژیک بنام زیر نوع براي آن شناخته شده است. زیر نوع ها داراي یک شاخص آنتی ژنی مشترك بنام
a بوده و بر اساس نوع اسید آمینه موجود در دو محل 122 و 166 در ترکیب با چهار شاخص آنتی ژنیک دیگر تقسیم بندي می شوند. ژنوتیپ D شایعترین ژنوتیپ در ایران می
باشد (زیر نوع هاي ayw2-ayw-ayw3 .(در جریان خون ویروس هپاتیت B به شکل ساختمانهاي کروي شکل بنام پارتیکل Dane وجود دارد که حاوي یک پوشش و یک
حفره مرکزي از پروتئینهاي نوکلئو کپسید است. اولین شاخص عفونت هپاتیت B آنتی ژن سطحی یا HBsAg است که براي یک دوره زمانی دو تا دوازده هفته اي پس از تماس
با ویروس و قبل از پدیدار شدن شواهد بیوشیمیایی درگیري کبد در خون وجود دارد و ممکن است در این دوره فرد مبتلا فاقد علائم بالینی باشد. در این دوره با روشهاي حساس
وجود آنتی ژن در جریان خون قابل رد یابی است. در بیمارانی که از بیماري بهبود می یابند HBsAg در طی مدت 20 – 12 هفته پس از شروع علائم بالینی و یا افزایش مقدار
آنزیمهاي اختصاصی کبد از جریان خون حذف می شود. پایداري آنتی ژن در جریان خون به مدت بیشتر از شش ماه وضعیتی بنام حامل مزمن را ایجاد می کند. HBsAg یک
شاخص عفونت هپاتیت B است که نقش اساسی را در تشخیص عفونت حاد و شناسائی موارد مزمن به عهده دارد. کیت موجود توانائی تشخیص HBsAg را با حساسیت و ویژگی
مناسب در نمونه هاي سرم و پلاسما دارد .
اساس آزمایش :
اساس آزمایش در این کیت بر روش Immunoassay Enzyme Sandwich دو مرحله اي استوار است. در مرحله اول Ag HBs موجود در نمونه بطور همزمان با آنتی بادي
هاي منوکلونال و پلی کلونال کوت شده در چاهک ها و آنتی بادي ضد HBsAg نشاندار شده با بیوتین (کنژوگه 1 (واکنش می دهد. پس از طی زمان انکوباسیون در مرحله دوم
با افزودن کنژوگه حاوي کمپلکس استرپتاویدین- پراکسیداز (کنژوگه 2 (استرپتاویدین به بیوتین موجود در کنژوگه اول متصل می گردد. پس از انکوباسیون و شستشو محلول
سوبسترا و کروموژن به چاهکها اضافه می شود. رنگ آبی ایجاد شده بعد از این مرحله نتیجه تجزیه سوبسترا در اثر فعالیت آنزیم و تغییر رنگ محلول کروموژن ناشی از این
واکنش است. شدت این رنگ متناسب با تعداد کمپلکسهاي ایمنی ایجاد شده در چاهکها می باشد. با افزودن محلول متوقف کننده، رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین
جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1 (پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با دو آنتی بادي منوکلونال و پلی کلونال علیه Ag HBs.
2 (محلول کونژوگه 1) Conjugate1 : (آنتی بادي منوکلونال نشاندار با بیوتین در محلول بافري به رنگ قرمز حاوي پروتئین و نگهدارنده، یک ویال حاوي 5/3 میلی لیتر . این
محلول آماده مصرف می باشد .
3 (محلول کونژوگه 2) Conjugate2 : (استرپتاویدین – پراکسیداز در محلول بافري به رنگ آبی حاوي پروتئین و نگهدارنده. یک ویال حاوي 5/3 میلی لیتر. این محلول آماده
مصرف می باشد .
4 (سرم کنترل مثبت (Control Positive : (حاوي ml 2 محلول بافري به رنگ بنفش داراي پروتئین به عنوان پایدار کننده و 05/0 %کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی
غیر فعال شده داراي آنتی ژن HBsAg.
5 (سرم کنترل منفی (Control Negative : (حاوي ml 3 محلول بافري به رنگ زرد و 05/0 %کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی منفی از نظر HBsAg.
6 (محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen : (حاوي تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه، 1 ویال محتوي 12 میلی لیتر (آماده براي مصرف) .
7 (محلول شستشو (Buffer Wash : (محلول بافر فسفات و 05/0 %توئین ، یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (10X . (جهت تهیه محلول شستشوي آماده
مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 10/1 رقیق نمایید .
8 (محلول متوقف کننده (Solution Stop : (اسید کلریدریک 1 نرمال ، یک ویال محتوي 6 میلی لیتر .
9 (برچسب مخصوص پلیت .
2
تهران، شهرك گلستان، بلوار گلها، خیابان یاس سوم ، نبش خیابان یاسمن ، پلاك1 ،کد پستی 1494734463
تلفن 42197000) خط ویژه) فکس 42197007
sms 300071402 info@pishtazteb.com www.pishtazteb.com
ویرایش هفتم – خرداد 1396
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1 (دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان فیلتر 630 نانومتر به عنوان رفرانس) .
2 (سمپلر هاي 25 و 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3 (بن ماري یا انکوباتور 37 درجه سانتی گراد .
4 (محلول هیپوکلریت سدیم 5 %یا محلول ضد عفونی کننده دیگر .
5 (آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1 (محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2 (این کیت صرفا جهت تعیین HBsAg در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است. از مخلوط کردن نمونه ها ي سرم پرهیز نمایید .
3 (از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4 (کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود آنتی ژن HIV و آنتی بادیهاي HIV و HCV کنترل گردیده و فاقد این عوامل میباشند. جهت احتیاط بهتر است
کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
5 (هنگام انجام آزمایش حتماً از دستکشهاي یکبار مصرف استفاده کنید . همچنین استفاده از عینکهاي آزمایشگاهی هنگام کار با سرمهاي بیماران توصیه می شود .
6 (سرمهاي مثبت از نظر HBsAg ،وسایل و محلولهاي شستشو مشکوك به آلودگی را بعد از اتمام کار به مدت حداقل30 دقیقه در مجاورت محلول هیپوکلریت سدیم 5 %یا
محلولهاي مناسب ضد عفونی کننده دیگر قرار دهید . همچنین اتوکلاو کردن به مدت 20 دقیقه در 121 درجه سانتی گراد نیز پیشنهاد می گردد .
هشدار هاي توصیه اي:
از این کیت فقط در مقاصد تشخیصی استفاده شود . این کیت براي مقاصد غربالگري تولید نشده است .
شرایط نگهداري :
1 (کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2 (چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3 (پایداري محتویات کیت (قبل از باز شدن درب کیت) تا پایان مدت انقضاء درج شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
با آب مقطر رقیق نمایید این محلول (آماده مصرف) به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتیگراد قابل نگهداري و مصرف می باشد . 10/1 4 (محلول شستشو را به نسبت
37 در جه سانتی گراد قرار دهید) . (ممکن است در محلول شستشوي غلیظ کریستال تشکیل شود که این امر مشکلی را ایجاد نمی نماید . قبل از تهیه محلول شستشوي کار براي حل شدن کریستالها ویال را در
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم و یا پلاسماي داراي EDTA را می توان پس از جدا نمودن ازسلولهاي خون استفاده نمود ، اما از سرم یا پلاسماي رقیق شده یا Pooled با نمونه هاي دیگر نباید استفاده
کرد. نمونه را می توان به مدت یک هفته در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر در دماي 20 -درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از
thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) . وجود آلودگی میکروبی ، کدورت ، همولیز ، لیپمی و زردي در نمونه ، ممکن است موجب تداخل در نتیجه نهایی آزمایش گردد .
توضیحات عمومی :
1 (قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید . جهت ماندگاري بهتر پلیت ، پلیت را بعد از رسیدن به دماي محیط از کیسه مخصوص آن
خارج کرده و چاهکهاي مورد نیاز را بردارید .
2 (بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .

3 (از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4 (پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5 (براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6 (از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان مناسب انکوباسیون می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را آماده
نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج مطلوب تري می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1 (تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید . چاهک اول را به عنوان
بلانک در نظر گرفته و دو چاهک بعدي را براي کنترل منفی و یک چاهک را براي کنترل مثبت در نظر بگیرید .
2 (100 میکرولیتر (µl (از سرم کنترل منفی- مثبت و نمونه ها را به چاهکهاي مربوطه به جز چاهک بلانک اضافه نمایید .
3 (25 میکرولیتر (l (محلول کونژوگه 1) Conjugate1 (را به همه چاهکها به جز چاهک بلانک، اضافه نمایید. با افزودن کنژوگه 1رنگ نمونه سرم ها صورتی رنگ می شود.
4 (درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 15 ثانیه به ملایمت تکان دهید. سپس به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید .
5 (بدون شستشوي چاهکها 25 میکرولیتر از محلول آنزیم کونژوگه 2) Conjugate2 (را داخل کلیه چاهکها به استثناء چاهک بلانک اضافه نمایید. درب چاهکها را با
برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 15 ثانیه به ملایمت تکان دهید. با افزودن کنژوگه 2 رنگ کنترل منفی از زرد به سبز و رنگ کنترل مثبت و نمونه ها
بنفش می شوند .
6 (پس از پوشاندن چاهکها توسط بر چسب مخصوص پلیت، چاهکها را به مدت 30 دقیقه در37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید .
7 (محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. براي شستشو چنانچه دستگاه شستشوي اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
شستشو حدود 300 میکرولیتر (l (محلول شستشو در هر چاهک ریخته ، سپس 15 ثانیه صبر کرده (time Soaking (و بعد چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد. در هر دفعه
نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .
8 (100 میکرولیتر محلول سوبسترا- رنگزا به چاهک اضافه نمایید و به مدت 15 دقیقه در دماي اتاق و تاریکی انکوبه نمایید .
9 (با اضافه کردن 50 میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک، ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري هر چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر
450nm استفاده نمایید و جذب نوري تمامی چاهکها را در مقابل بلانک قرائت نمایید (توصیه می شود از فیلتر 630nm بعنوان فیلتر رفرانس استفاده شود) .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش می باشد .
* جذب نوري کمتر از 1.0 براي بلانک ، در صورت بیشتر بودن جذب نوري بلانک احتمالاً محلول رنگزا آلوده شده است .
* میانگین جذب نوري کمتر از 15.0 براي کنترل منفی، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است، آزمایش را دوباره انجام داده
و در مراحل شستشو دقت کنید .
* جذب نوري بیشتر از 8.0 براي کنترل مثبت .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
1 (جذب نوري کنترلها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج 450nm و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس 630nm بخوانید .
2 (جهت محاسبه off- Cut از فرمول زیر استفاده نمایید (جذب نوري بلانک را باید از جذب نوري همه نمونه ها و کنترلها کم نمود) .
Cut-off value = منفی کنترلهاي جذب میانگین+ 0/05
براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی می توان از محاسبه اندکس Co/S نیز استفاده کرد .

جهت به دست آوردن اندکس Co/S از فرمول استفاده نمایید. مطابق این فرمول کلیه جوابها یی که Co/S آنها عدد 1 و یا بیشتر از یک باشد،
مثبت و کلیه جوابها یی که Co/S آنها کمتر از 1 باشد، منفی تلقی میشوند .
تفسیر نتایج :
– جوابهاي مثبت باید مجدداً˝ تکرار شوند . نمونه هاي مثبتی که در تکرار مجدد منفی میشوند ، باید منفی گزارش گردند. مثبت شدن آزمایش در مرتبه اول می تواند به سبب – جواب منفی نشاندهنده عدم وجود HBsAg و یا غیر قابل سنجش بودن آنتی ژن (در مراحل اولیه عفونت) می باشد .
خطاي کاري در شستشو یا نمونه برداري باشد. در صورت مثبت شدن آزمایش در مرحله تکرار آن، نمونه بایستی با روشهاي تاییدي خنثی سازي (Neutralization (مورد تایید
قرار گیرد.
شاخصهاي اجرایی :
1 (حساسیت : جهت بررسی حساسیت کیت، از فراورده هاي بین المللی زیر استفاده شده است :
2 – nd WHO International Standard, NIBSC code 00/588
BBI Hepatitis B surface antigen Sensitivity panel –PHA808- Hepatitis B surface antigen Sensitivity panel –PHA808
بر این اساس حساسیت سنجش براي زیر نوع ay , ad کمتر از 2/ml0/ng و یا کمتر از 05/0 ml/IU تعیین شد .
از پانل Titer Low نیز براي تعیین وضعیت حساسیت کیت استفاده شد .
S/Co Ratio
Pishtazteb BBI ng/ml IU/ml PEI U/ml HBs Ag
subtype Member ID
1 ad 2.49 0.71 0.53 12.5
2 ad 1.17 0.31 0.20 6.5
3 ad 1.02 0.28 0.17 5.6
4 ad 0.96 0.22 0.15 4.3
5 ad 0.69 0.15 0.10 2.8
6 ad 0.50 0.12 0.08 2.5
7 ad 0.41 0.08 0.06 1.9
8 ad 0.37 0.06 0.05 1.6
9 ad 0.30 0.05 0.04 1.4
10 ad 0.23 0.02 0.02 0.9
11 ay 2.51 0.67 0.83 11.0
12 ay 1.26 0.30 0.33 5.8
13 ay 0.96 0.22 0.25 4.6
14 ay 0.77 0.19 0.19 4.1
15 ay 0.63 0.14 0.16 3.0
16 ay 0.48 0.11 0.13 2.7
17 ay 0.42 0.09 0.10 2.2
18 ay 0.33 0.06 0.08 1.5
19 ay 0.23 0.04 0.05 1.2
20 ay 0.13 0.01 0.03 0.8
21 * 0.03 0.00 0.00 0.4
Sample
OD
Cut-off value

HBs Ag Low Titer Performance Panel (Modified) PHA106
Behring
Enzygnost
S/Co
Ortho
System3
S/Co
Biorad
Monolisa
S/Co
Abbott
AxSYM
S/Co
HBsAg
Concentration
IU/ml
Pishtazteb
S/Co Ratio
Member
ID
106-1 2.8 0.05 1.3 1.1 1.0 1.5
106-2 2.4 0.1 1.7 1.5 2.2 2.5
106-3 8.1 0.4 4.2 5.1 7.4 7.8
106-4 7.2 0.3 3.6 3.0 4.9 3.9
106-5 3.0 0.1 1.6 1.4 1.8 2.0
106-6 11.6 0.6 5.7 8.0 11.0 9.8
106-7 0.7 * 0.5 * 0.0 0.3
106-8 9.6 0.4 3.8 4.5 5.7 5.5
106-9 4.3 0.1 1.9 1.9 2.2 2.8
106-10 6.6 0.4 3.5 3.7 7.1 4.3
106-11 2.6 0.2 4.7 1.1 2.1 5.4
106-12 3.0 0.1 1.7 1.5 2.2 2.1
106-13 8.2 0.3 3.8 5.3 7.6 5.9
106-14 – – – – – – 106-15 – – – – – – Panel members 14 and 15 are no longer available.
HBsAg Mixed Titer Performance Panel (PHA206)
Behring
Enzygnost
S/Co
Ortho
Vitros
S/Co
Gen.Sys
S/Co
Abbott
AxSYM
S/Co
Pishtazteb
S/Co
Ratio
Member ID
206-1 0.5 0.5 0.4 0.1 0.2
206-2 >30.0 31.8 24.6 96.1 33.9
206-3 >30.0 22.4 24.6 70.0 43.9
206-4 >30.0 226 24.6 4455 43.9
206-5 >30.0 233 24.6 3999 43.9
206-6 >30.0 186 24.6 3340 43.9
206-7 29.0 21.6 24.6 56 43.9
206-8 28.0 14.9 20.5 36.7 37.3
206-9 29.0 18.7 23.6 40.7 22.2
206-10 14.0 6.3 13.2 17.7 13.4
206-11 18.0 8.1 12.1 13.4 10.6
206-12 21.0 9.8 18.2 25.5 20.3
206-13 15.0 8.2 14.2 15.1 26.2
206-14 11.0 4.8 7.6 10.4 7.9
206-15 4.0 2.6 3.6 2.4 6.6
206-16 7.7 2.8 6.6 5.3 7.1
206-17 2.7 1.6 2.2 0.7 1.7
206-18 3.4 1.7 3.4 2.0 2.9
206-19 2.8 3.0 3.3 1.6 2.6
206-20 6.8 3.6 5.3 5.9 11.8
206-21 6.0 4.6 6.7 4.9 6.8
206-22 1.8 1.2 1.6 1.3 1.6
206-23 2.8 1.4 2.5 1.8 2.4
206-24 2.7 1.3 3.7 0.9 2.2
206-25 0.8 0.7 0.4 0.1 0.4

جهت بررسی حساسیت از پانل هاي seroconversion استفاده شده است که به عنوان نمونه چند پانل ذکر می شود .
Hepatitis B Seroconversion Panel (subtype ad) PHM914
Hepatitis B Seroconversion Panel (Subtype ad) PHM909
پپ
2 (ویژگی آزمایش : 2025 نمونه ازافراد سالم در مقایسه با این کیت و یک کیت الایزاي دیگرمورد آزمایش قرارگرفت که نتایج به شرح زیر است :
تعداد نمونه تعداد نمونه با واکنش مثبت در تست اولیه تعداد نمونه با واکنش مثبت در تکرار مثبت تائید شده
1 1 2 2025
3 (دقت آزمایش : جهت بررسی تکرار پذیري کیت، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک سري آزمایش) و میان سنجی (در سري آزمایشات مختلف از یک سري ساخت)
بوسیله نمونه هاي مثبت و منفی انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است :
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD% CV – آزمون دقت درون سنجی (assay- Intra: (
3/5 0/078 2/2 20 1 مثبت نمونه
4/9 0/067 1/35 20 2 مثبت نمونه
4/7 0/0095 0/2 20 3 مثبت نمونه
5/1 0/0028 0/055 20 منفی نمونه
Days since
1 st bleed
HBsAg
ng/ml
Pishtazteb
S/Co
Abbott
AxSYM
S/Co
Biorad
Monolisa S/Co
Ortho
Vitros
S/Co
Behring
S/Co
Gen.Sys
S/Co
914-01 0 <0.1 0.7 0.6 0.0 0.1 0.5 0.4
914-02 146 0.2 1.3 0.7 0.2 0.3 0.5 2.1
914-03 151 0.3 1.8 0.9 0.4 0.5 0.6 2.5
914-04 153 0.5 2.0 1.0 0.5 0.8 0.7 3.7
914-05 158 0.9 3.5 1.4 1.0 2.3 1.1 6.0
914-06 160 1.5 6.3 2.2 1.9 4.4 1.5 9.5
Days since
1 st bleed
HBsAg
ng/ml
Pishtazteb
S/Co
Abbott
IMx
S/Co
BioMerieux
S/Co
Ortho
EIA
S/Co
Behring
S/Co
Gen.Sys
S/Co
909-01 0 <0.1 0.7 0.5 0.1 0.0 0.6 0.6
909-02 4 <0.1 0.8 0.5 0.1 0.0 0.5 0.6
909-03 7 0.1 0.9 0.6 0.1 0.0 0.6 0.8
909-04 9 0.3 1.3 0.8 0.3 0.2 0.6 2.3
909-05 14 1.1 4.7 1.5 1.0 2.1 1.8 10.3
909-06 18 >2.7 11.1 2.8 5.5 7.1 5.6 19.9
909-07 21 >2.7 20.0 5.6 13.3 16.2 11.6 23.3

– آزمون دقت میان سنجی (assay- Inter: (
*هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
References:
A.A. poulou and S.P.Dourakis .Genetic Heterogeneity of Hepatitis Viruses and its Clinical Significance. Curr Drug TargetsInflammation and Allergy.2005, 4:47-55. K.Kidd Ljunggren and et al . Clinical and Serological Variation Between Patients Infected with Different Hepatitis B Virus
Genotypes.J Clin Microbiol 2004,42(12):5837-5841. N.Gitlin.Hepatitis B: Diagnosis, Prevention and Treatment. Clin Chem ,1997,43(8):1500-1506. A.J.Zuckerman.Special Serological Diagnosis of Viral Hepatitis.British Medical Journal.1979,84-86. D.Chen and L.A.Kaplan.Performance of a New Generation Chemiluminescence Assay for Hepatitis B Surface Antigen.Clin
Chem,2006,52(8):1592-1598. شماتیک بصورت آزمایش انجام روش
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي علیه Ag HBs
کنترل ها – 100 میکرولیتر – محلولها بلانک کنترل ها نمونه
نمونه – – 100میکرولیتر سرم یا پلاسما
کنژوگه 1 – 25 میکرولیتر 25 میکرولیتر
با حرکت ملایم محتویات پلیت را به مدت 15 ثانیه مخلوط نمایید . دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید سپس 30
دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید .
کنژوگه 2 – 25 میکرولیتر 25 میکرولیتر
با حرکت ملایم محتویات پلیت را به مدت 15 ثانیه مخلوط نمایید . دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید سپس 30
دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5
بار چاهک را بشویید . هر مرحله شستشو نیاز به time soaking 15 ثانیه اي دارد .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در مقابل بلانک و در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت
کنید .
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD% CV
5 0/105 2/1 20 1 مثبت نمونه
5/5 0/072 1/3 20 2 مثبت نمونه
7 0/014 0/2 20 3 مثبت نمونه
8/4 0/0042 0/05 20 منفی نمونه