کیت الایزای LH

LHهورمونی گلیکوپروتئینی است که از سلولهاي بازوفیلیک بخش قدامی غده هیپوفیز ترشح می شود . ترشح LH توسط هورمون آزاد کننده (GnRH (که از
هیپوتالاموس ترشح می شود تحریک می گردد . از طرف دیگر هورمونهاي استروئیدي و مهاري (Inhibin (اثرات فیدبک منفی و مثبت بر عملکرد LH دارند . ترشح LH
داراي یک الگوي نوسانی میباشد که در خانمها نسبت به آقایان با وضوح بیشتري قابل مشاهده است . در خانمها در دوره عادت ماهانه غلظت LH داراي تغییراتی است
بدین ترتیب که در آغاز عادت ماهانه (فاز فولیکولار) و در انتهاي آن (فاز لوتئال) غلظت این هورمون پایین است. با افزایش LH در اواسط دوره عادت ماهانه عمل تخمک
گذاري (اوولاسیون) صورت می پذیرد . در خانمهاي یائسه به علت فقدان وجود اثر مهاري هورمونهاي استروئیدي مترشحه از تخمدان مقدار LH افزایش می یابد. در
اطفال میزان LH پایین بوده و تا قبل از سن بلوغ داراي تغییراتی نمی باشد . سنجش LH در خانمها جهت بررسی اختلالات عادت ماهانه ، آمنوره اولیه و ثانویه ، آقایان هورمون LH با اثر بر سلولهاي لایدیگ بیضه باعث تحریک ساخته شدن تستوسترون می شود که وجود تستوسترون براي عمل اسپرماتوژنز ضروري است . در
هیرسوتیزم و ویریلیزم بکار می رود . افزایش ناگهانی LH در آقایان در موارد ناباروري ، هیپوگنادیسم ، ژنیکوماستیا جهت بررسی عملکرد غدد هیپوتالاموس و هیپوفیز
حائز اهمیت می باشد . کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون هورمون LH را با اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی علیه یک شاخص آنتی ژنیک مولکول LH
پوشش داده میشوند (Coating (. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود. سپس آنتی بادي ثانویه ضد LH متصل به آنزیم HRP به
چاهکها اضافه می شود. مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت LH در نمونه ها متناسب است. پس از شستشو ، محلول رنگزا که محتوي هیدروژن
متوقف کننده ، رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد . پراکسید (2O2H (و کروموژن است، داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدیده آمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب است . با افزودن محلول
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد LH) Plate Coated LH – Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme LH (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي صفر ، 2/5 ، 5 ، 25 ، 50 و 100 L/IU از LH کالیبره شده بر مبناي IS nd2 WHO
80/552 (استاندارد صفر حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترل (Serum Control (: یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate – Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را
با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
7) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
8) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .

3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند
جهت احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می
باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه می تواند براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري بیش از
مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهک ها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را وسط چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب ، زمان انکوباسیون مناسب می باشد . بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز
را آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
8) به دلیل مشابه در بند 7 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را داخل هر چاهک بریزید . پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن به
خوبی مخلوط شوند .
4) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد. در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate – Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
7) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
8) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري از دستگاه
الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .

محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (Point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر
وصل نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه
نشان خواهد داد . این خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال LH در سرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود
را بدست آورد :

میانگین رنج طبیعی
(IU/L)
رنج طبیعی
(IU/L)
6
34
7
1 – 11
10 – 80
1 – 14
خانمهاي نرمال قبل از یائسگی :
در فاز فولیکولار
در اواسط دوره عادت ماهانه
در فاز لوتئال
خانمهاي یائسه 44 – 8/1 24
مردان زیر 60 سال 8/6 – 1/2 4/8

شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت LH قابل تشخیص در این کیت L/IU 1 می باشد .
2) دقت آزمایش :
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف hLH انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است : آزمایشهاي اینترا – اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر – اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشات
جدول شماره1 (اینترا- اسی) :
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
(IU/L)
SD CV
(%)
7 0/4 5/7 10 1
4/3 0/9 20/8 10 2
6/9 3/8 54/7 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از hLH به 4 سرم با غلظتهاي مشخص hLH افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدار hLH موجود در سرم نمونه
(IU/L)
مقدار افزوده شده hLH
(IU/L)
مقدار مورد انتظار
(IU/L)
مقدار بدست آمده
(IU/L)
ریکاوري
(%)
94 8 8/5 5 12 1
105 19/5 18/5 25 12 1
97 30 31 50 12 1
109 18/5 17 5 29 2
96 26 27 25 29 2
104 41 39/5 50 29 2
104 25/5 24/5 5 44 3
96 33 34/5 25 44 3
104 49 47 50 44 3
101 34 33/5 5 62 4
95 41/5 43/5 25 62 4
104 58 56 50 62 4
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست
(IU/L)
SD CV
(%)
4/9 0/3 6/1 24 1
4/5 1 22 24 2
4/4 2/4 55 24 3

۴) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 6 نمونه سرم با غظت مشخص از hLH تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
شده است .
5) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهایی با غلظتهاي مختلف hTSH , hFSH و hCG جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با hLH بررسی شد که نتایج آن در جدول
زیر آمده است :
غلظت ظاهري hLH آنالیت غلظت
(IU/L)
hFSH
(IU/L)
500
250
100
50
< 1
hTSH
(mIU/L)
500
250
100
50
< 1
hCG
(IU/L)
100000
10000
1000
100
< 1
٦) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش hLH جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا L/IU 2500 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
Reference :
Wide L. Human pituitary gonadotropins. In : Loraine JA , Bell ET I eds, Hormone assays and their clinical application . 4
th
,Edinburgh , London and New York : Churchill Livingstone , 1976 : 78-140 .
مقدار hLH موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(IU/L)
ریکاوري (%)
رقت
1/2
رقت
1/4
رقت
1/8
رقت
1/16- 99 104 98 8/5 1
97 95 102 99 24 2
94 104 96 100 32 3
97 103 94 98 39 4
96 95 107 101 48 5
98 100 98 96 87 6

روش انجام آزمایش LH بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد LH
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهک ها به خوبی مخلوط شوند و سپس
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت
را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر
(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .