کیت الایزای Prolactin

کیت سنجش Prolactin به روش الایزا
مقدمه :
پرولاکتین هورمون پلی پپتیدي است که از بخش قدامی غده هیپوفیز ترشح می شود. ترشح پرولاکتین توسط فاکتورهاي آزاد کننده و مهار کننده که از هیپوتالاموس
ترشح می شوند تنظیم می گردد. در دوران بارداري و پس از تولد نوزاد غلظت پرولاکتین افزایش می یابد، استرسهاي روحی و فیزیکی و هیپوگلیسمی نیز می توانند
باعث افزایش غلظت پرولاکتین گردند. از طرفی هیپرپرولاکتینمیا می تواند موجب کم کاري گنادها گردد بنابراین سنجش میزان پرولاکتین در موارد ناباروري از ارزش
برخی عوارض هیپرپرولاکتینمیا عبارتند از انواعی از ماکرو و میکرو آدنوماها ، هیپوتیروئیدیسم و اختلالات کلیوي . بالائی برخوردار است. در خانمها افزایش پرولاکتین می تواند باعث ایجاد اختلال در عادت ماهانه گردد و در آقایان باعث تضعیف قدرت جنسی شود. از نظر پاتولوژیک
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهائی علیه یک شاخص آنتی ژنیک مولکول
پرولاکتین پوشش داده می شوند (Coating(. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود، سپس آنتی بادي ثانویه ضد پرولاکتین
متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه می شود. مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت پرولاکتین در نمونه ها متناسب است. پس از شستشو محلول
رنگزا که حاوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده متناسب است با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در
چاهکها ، با افزودن محلول متوقف کننده، رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد پرولاکتین (Plate Coated PRL-Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme PRL (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آماده مصرف .
3) سري استانداردها (Set Standard (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي صفر ، 50 ، 100 ، 500 ، 1500 و 3000 L/mIU از PRL کالیبره شده بر مبناي WHO
3
rd
84/500 IS) استاندارد صفر حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترل : یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate – Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آماده مصرف .
6) محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به
نسبت 1/20 رقیق نمائید .
7) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
8) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمائید .
3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت
احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد.

جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه می تواند براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري بیش از
مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد . از ذوب و فریز نمودن مکرر نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را وسط چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز
را آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
8) به دلیل مشابه در بند 7 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نمائید و پلیت را به ملایمت به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن
4) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید . به خوبی مخلوط شوند .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (substrate – Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
7) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
8) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري از دستگاه
الایزا ریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 ( بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر
وصل نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمائید بطوریکه این خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را
نشان خواهد داد .

جذب نوري (L/mIU(استانداردها
0 0/02
50 0/17
100 0/31
500 1/1
1500 2/02
3000 2/55

توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .

مقادیر مورد انتظار :
مقادیر طبیعی پرولاکتین درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر
طبیعی خود را بدست آورد

انگین محدوده
(mIU/L) طبیعی
محدوده طبیعی
(mIU/L)
آقایان 170 433 – 31
خانمهاي یائسه 195 413 – 33
خانمها قبل از یائسگی 251 555 – 118

ng/ml x 21.2 = mIU/L mIU/L x 0.0472 = ng/ml

شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD(، حداقل غلظت پرولاکتین قابل تشخیص در این کیت L/mIU 15 می باشد .
2) دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا – اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر – اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشات
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف hPRL انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست جدول شماره1 (اینترا – اسی) :
(mIU/L)
SD
CV
(%)
5/7 2 35 24 1
3/8 11/2 293 24 2
3/4 42/3 1250 24 3
نمونه تعداد دفعات تکرار تست جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
میانگین
(mIU/L
)
SD
CV
(%)
6/5 2/4 36/6 10 1
5/1 14/6 285 10 2
4/1 53/1 1297 10 3

هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از hPRL به 4 سرم با غلظتهاي مشخص hPRL افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدار hPRL موجود در سرم نمونه
(mIU/L)
مقدار افزوده شده hPRL
(mIU/L)
مقدار مورد انتظار
(mIU/L)
مقدار بدست آمده
(mIU/L)
ریکاوري
(%)
95 90 95 50 140 1
97 117 120 100 140 1
102 327 320 500 140 1
98 425 435 500 370 2
96 660 685 1000 370 2
104 970 935 1500 370 2
106 560 525 100 950 3
103 750 725 500 950 3
97 950 975 1000 950 3
102 990 965 100 1830 4
107 1250 1165 500 1830 4
97 1370 1415 1000 1830 4

٤) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 4 نمونه سرم با غظت مشخص از hPRL تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن
آورده شده است .
مقدار hPRL موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(mIU/L)
ریکاوري (%)
رقت
1/2
رقت
1/4
رقت
1/8
رقت
1/16
98 100 102 94 670 1
103 96 103 96 1400 2
98 97 98 100 2300 3
96 98 98 98 2800 4
۵) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهائی با غلظتهاي مختلف hFSH ، hLH ، hTSH و hCG جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با hPRL بررسی شد که نتایج آن
در جدول زیر آمده است

جدول اختصاصیت (واکنش متقاطع) :
غلظت ظاهري hPRL آنالیت غلظت
(mIU/L)
hFSH
(IU/L)
500
250
100
50
< 15
hTSH
(mIU/L)
500
250
100
50
< 15
hCG
(IU/L)
200000
100000
10000
1000
< 15
hLH
(IU/L)
500
250
100
50
< 15
6) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش پرولاکتین جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا L/mIU 15000 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .

References :
Bergh T., Nillius S.H., Wide L. (1977) Hyperprolactinaemia in amenorrhoea incidence and clinical significance. Acta. Endocrinol. 86:683-694.
Seppala M. (1978) Prolactin and female reproduction. Ann. Clin. Res. 10:164-170. Thorner M.O., McNeilly A.S., Hagan C. (1974) Long-term treatment of galactorrhoea and hypogonadism with bromocriptine.Br. Med. J 2:4 . شماتیک بصورت Prolactin آزمایش انجام روش
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد پرولاکتین
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهک ها به خوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت
بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .