کیت الایزای T-Uptake

کیت سنجش uptake- T به روش الایزا
مقدمه :
غده تیروئید تحت تنظیم هورمون تیروتروپین ، هورمونهاي T3 و T4 را ترشح می کند ، این هورمونها بصورت آزاد در گردش خون به مقدار ناچیزي وجود داشته و مقدار
اعظم آنها بصورت باند با پروتئینهاي حامل وجود دارند ، سه پروتئین با تمایل و ظرفیتهاي متفاوت براي T3 و T4 شناخته شده اندکه عبارتند از TBG که 75 – 65 درصد
از ظرفیت حمل هورمونهاي تیروئیدي را به عهده دارد ، TBPA) albumin-pre binding Thyroxine (که 25 -15 درصد از ظرفیت حمل هورمونهاي تیروئیدي را به
عهده دارد ، و آلبومین که کمترین تمایل به هورمونهاي تیروئیدي را داشته ولی ظرفیت بالایی را دارا می باشد و 10 درصد از هورمون تیروکسین و 30 درصد از هورمون T3
در دسترس را حمل می کند. از آنجائیکه پروسه متابولیسم کاملاً توسط فرم آزاد هورمونهاي تیروئیدي تنظیم می گردد واین مقدار هورمونهاي آزاد وابستگی کاملی با میزان
ظرفیت پروتئینهاي حامل آنها دارد، اندازه گیري میزان این پروتئینها اهمیت می یابد. تا کنون جهت اندازه گیري ظرفیت پروتئینهاي حامل هورمونهاي تیروئیدي از روشهاي
متعددي شامل روش: Silicates , exchange-Ion و albumin Denatured استفاده شده است و یکی از جدیدترین و ساده ترین روشها روش EIA Enzyme(
(Immunoassay بوده که داراي حساسیت مناسبی نیز می باشد .
اساس آزمایش :
اساس این آزمایش بر روش سنجش رقابتی استوار است به این ترتیب که چاهکهاي پلیت با آنتی بادي ضد T4 پوشانده شده اند و در هنگام انجام آزمایش هورمون T4 به
بادیهاي کف چاهک با هورمون T4 کونژوگه رقابت می نماید ، بنابراین هر چه ظرفیت حمل پروتئینهاي سرم بالاتر باشد مقدار T4 کمتري براي رقابت با T4 کنژوگه باقی را جذب می نمایند ، ولی نمیتوانند با هورمون T4 کنژوگه واکنشی نشان دهند در نتیجه مقداري از T4 که جذب پروتئینهاي حامل نگردیده است بر سر اتصال به آنتی همراه T4 کنژوگه شده با آنزیم HRP و سرم به چاهکها اضافه میشوند. در این هنگام پروتئینهاي حامل هورمونهاي تیروئیدي بر حسب ظرفیت خود مقداري از هورمون T4
مانده و در رقابت با آن در اتصال به آنتی بادیهاي کف چاهکها نا موفق تر خواهد بود (و بالعکس) ، پس از شستشو محلول سوبسترا به چاهکها اضافه میگردد که هر چه
بالا بوده بنابراین مقدار کمتري T4 براي رقابت باقی مانده است (و بالعکس) ، براي جلوگیري از فعالیت بیش از اندازه و نامناسب آنزیم ، محلول متوقف کننده افزوده می میزان رنگ زایی بیشتر باشد بیانگر بالاتر بودن میزان اتصال هورمون T4 کونژوگه بوده و این خود به این معنی است که مقدار T4 برداشت شده توسط پروتئینهاي حامل
گردد که فعالیت آنزیم را مختل کرده و رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1 (یک پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد T4) Plate Coated T4-Anti. (
2 (محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3 (اسی بافر (buffer Assay : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
4 (سري استانداردها (Set Standards : (4 ویال استاندارد شامل غلظتهاي تقریبی 15، 5/26 ، 5/35 و 46 درصد .غلظت دقیق هر استاندارد بر روي ویال استانداردها درج
گردیده است (هر ویال حاوي 5/0 میلی لیتر می باشد) .
5 (سرم کنترل : یک ویال حاوي 5/0 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
6 (محلول شستشو (Solution Wash : (یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X 20 . (جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف مقدار لازم از محلول
شستشوي غلیظ را به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق کنید .
7 (محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen : (یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
8 (محلول متوقف کننده (Solution Stop : (یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9 (برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1 (دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2 (سمپلر هاي 25 ، 50 و 100میکرو لیتر دقیق .
3 (آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1 (محتویات این کیت فقط براي مصرف در همین کیت می باشد .

2 (از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3 (کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ، جهت
احتیاط بهتر است هر آزمایشگري که با کیت کار می کند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
شرایط نگهداري :
1 (کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2 (چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3 (پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4 (محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8-2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه را می توان براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري کرد ولی براي نگهداري
بیش از مدت دو روز باید از دماي 20 -درجه سانتی گراد استفاده گردد .
توضیحات عمومی :
1 (قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2 (بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3 (از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4 (پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5 (براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6 (در هنگام سمپلینگ ، تمام محلولها و نمونه ها را در وسط چاهکها بریزید .
7 (از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب ، زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
8 (به دلیل مشابه در بند 7 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1 (تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و باقی چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید.
2 (25 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید ، سپس 50 میکرولیتر اسی بافر
(Buffer Assay (و در پی آن 50 میکرولیتر آنزیم کنژوگه را در داخل چاهک ها ریخته و براي مدت 15 ثانیه پلیت را تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند
و آنگاه درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت یک ساعت در درجه حرارت اتاق (28 -22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
3 (چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک
به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس
چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمائید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا
قطرات اضافی خارج شوند) .
4 (100 میکرولیتر محلول رنگزا (substrate Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید و چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
5 (با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید . (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج:
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .

1 (جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450 ) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید .
2 (با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی بدست آید .
3 (میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمائید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد.
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار

مقادیر نرمال uptake-T در سرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر
نرمال خود را بدست آورد :
محدوده طبیعی % میانگین محدوده طبیعی %
30 25 – 35
شاخصهاي اجرایی :
1 (دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک بار آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه درچندین بارآزمایشهاي مختلف)
با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف Uptake-T انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است .
جدول شماره 1) اینترا- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین % SD% CV
2/7 0/59 22 24 1
2/4 0/84 35/4 24 2
1/5 0/70 45/3 24 3
جدول شماره 2) اینتر- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین % SD% CV
3/5 0/60 17/2 10 1
3/9 1/07 27/2 10 2
2/9 1/05 36 10 3
هر سري آزمایش به صورت Duplicate انجام شده است .

References:
Inada, M., and Sterling, K., Clin. Invest(1967),46,1442. Murphy,B.,1968, Radioisotopes in Medicine, U.S.Atomic Energy Commission, Technical Information Center, Tennessee.
Hollander, C.S. and Shenkman, L., 1974, Methods of Hormone Radioimmunnassay, Academic Press,New York. Hamolsky, M.W., Stein, M. and Freedberg, S.A.,J.Clin. Endocrionol.(1957),17,33.
Hebert, V., U. S. Patent Office #3(1971), 422, 819. Mitchell, M. L., Harden, A. B. and O Rouke, M. E., J. Clin. Endocrionol., ( 1960) 20, 1474. Rolleri, E., Buzzigoli, G., and Plassio, C., J. Nucl. Med. ( 1972)., 13, 892. Nusynowitz, M. L., and Ealiszewski, Am. J. Clin. Pathol. (1971)., 56. 523. Clark, F. and Horn, D. B., J. Clin. Endocrionol ( 1965). Metab., 25, 93. Young. D. S., Pestaner, L. C. and Gilberman, U., Clinical Chemistry ( 1975), 21, 3660. شماتیک بصورت T-uptake آزمایش انجام روش
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي جهت تست uptake- T
سرم کنترل – 25 میکرولیتر – استانداردها 25 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 25 میکرولیتر
اسی بافر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه
چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 60 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)قرائت
کنید