کیت الایزای TSH

TSH هورمون گلیکوپروتئینی است با وزن ملکولی 26600 دالتون که از بخش قدامی غده هیپوفیز ترشح می شود و از دو زیر واحد آلفا و زیر واحد اختصاصی بتا تشکیل
شده است ، زیر واحد آلفا شبیه زیر واحد آلفاي هورمونهاي گلیکو پروتئینی LH , FSH و hCG می باشد . ترشح TSH توسط هورمون آزاد کننده (TRH (تحریک می
گردد که این هورمون آزاد کننده، خود از هیپوتالاموس ترشح می شود . TSH با اثر بر غده تیروئید باعث سنتز و ترشح هورمونهاي تیروئیدي (شامل 3T و 4T (می گردد .
ترشح هورمون TSH توسط مقدار هورمونهاي تیروئیدي آزاد در جریان خون بصورت فیدبک منفی تنظیم می گردد. سنجش میزان TSH جهت بررسی و تشخیص
اختلالات غده تیروئید و همچنین بررسیهاي محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزي حائز اهمیت می باشد . کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون هورمون TSH را با
اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد . در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی علیه یک شاخص آنتی ژنیک زیر واحد
بتاي مولکول TSH پوشش داده می شوند (Coating(. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود، سپس آنتی بادي ثانویه ضد
TSHمتصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه می شود . مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت TSH در نمونه ها متناسب است . پس از شستشو محلول
رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است به داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب
است ، با افزودن محلول متوقف کننده ، رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) یک پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد TSH) Plate Coated TSH -Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme TSH (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي TSH ،0 0/5 , 2/5 ، 5 ، 15 و L/mIU 30) استاندارد صفر حاوي 2 میلی لیتر و سایر
80/558 nd استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند)، کالیبره شده در مقابل استانداردهاي 2 IRP WHO.
4) سرم کنترل(Serum Control (: یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با
آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
7) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر .
8 ) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر و در صورت امکان 630 نانومتر .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت تعبیه شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ، جهت
احتیاط بهتر است هر آزمایشگري که با کیت کار می کند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .

3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاء نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 2-8 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(حداکثر تا 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق رسانده و بخوبی تکان دهید تا کاملاً یکنواخت شوند .
2) بهتر است پس از شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث کسب نتایج دقیق تري می شود .
7) به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن بخوبی
مخلوط شوند .
4) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 60 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود
که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر بار شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول
شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي
یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی محلول شستشو خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
7) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
8) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید . (توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .

محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .

ا
جذب نوري (L/mIU(
0 0/03
0/5 0/07
2/5 0/24
5 0/42
15 1/16
30 2/17

جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید.
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال TSH در سرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود
را بدست آورد :
محدوده طبیعی در افراد بالغ
(mIU/L)
میانه محدوده طبیعی
(mIU/L) 0/32 – 5/2 1/8

شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت TSH قابل تشخیص در این کیت L/mIU 0.1 می باشد .
2) دقت آزمایش :
با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف TSH انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است : آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشهاي مختلف)
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست جدول شماره 1 (اینترا- اسی) :
(mIU/L )
CV% SD
6 0/015 0/25 16 1
3/9 0/17 4/35 16 2
4/5 0/53 11/7 16 3
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
(mIU/L )
CV% SD
8 0/02 0/25 20 1
7 0/31 4/4 20 2
8/4 1/02 12/1 20 3

هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .

3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از TSH به 4 سرم با غلظتهاي مشخص TSH افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدار TSHموجود در سرم نمونه
(mIU/L)
مقدار افزوده شده
(mIU/L) TSH
مقدار مورد انتظار
(mIU/L)
مقدار بدست آمده
(mIU/L)
ریکاوري
(%)
109 0/6 0/55 0/5 0/6 1
93 2/6 2/8 5 0/6 1
96 7/5 7/8 15 0/6 1
100 1/1 1/1 0/5 1/8 2
106 3/6 3/4 5 1/8 2
105 8/8 8/4 15 1/8 2
94 1/6 1/7 0/5 2/9 3
105 4/1 3/9 5 2/9 3
101 9 8/9 15 2/9 3
93 2/5 2/7 0/5 5 4
96 4/8 5 5 5 4
105 10/5 10 15 5 4
٤) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 4 نمونه سرم با غلظت مشخص از TSH تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
شده است :
مقدار TSH موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(mIU/L)
ریکاوري (%)
رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16
96 102 98 100 2/7 1
96 99 103 99 8/4 2
105 104 94 99 16/7 3
85 94 105 97 27/8 4
٥) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهایی با غلظتهاي مختلف hLH , hFSH و hCG جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با TSH بررسی شد که نتایج آن در جدول زیر
آمده است .
جدول اختصاصیت (واکنش متقاطع) :
غلظت ظاهري آنالیت غلظت
hTSH (mIU/L)
hFSH (IU/L)
1000
100
10 < 0/1
hLH (IU/L)
1000
100
10 < 0/1
hCG (IU/L)
100000
10000
1000 < 0/1

اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش TSH جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا L/mIU 500 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References:
Cobb W.E., Lamberton R.P Jackson I.M.D. (1984) Use of a rapid, sensitive immunoradiometric assay for thyrotropin to distinquish
normal from hyperthyroid subjects. Clin. Chem. 30:1558-1560.
Helenius T., Tikanoja S.( 1986) A sensitive and practical immunoradiometric assay of thyrotropin. Clin. Chem. 32 :514-518
Woodhead J.S., Weeks I. (1985) Circulating thyrotrophin as an index of thyroid function. Ann. Clin. Biochem. 22:455-459.
Lamberg B. A. , Helenius T., Liewendahl K. (1986) Assessment of thyroxine suppression in thyroid carcinoma patients with a
sensitive immunoradiometric TSH assay. Clin . Endocrinol . 25:259-263.
روش انجام آزمایش TSHبصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد TSH
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با بر
چسب مخصوص پلیت بپوشانید . 60 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را
خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .