کیت الایزا Echinococcus IgG

کیت سنجش آنتی بادي IgG ضد اکینوکوکوس به روش الایزا
مقدمه :

اکینوکوکوس گرانولوزوس انگلی است از کلاس سستودها به طول 1 تا 6 میلیمتر که گونه هاي مختلف آن بیشتر در سگ سانان شامل سگ ، گرگ و روباه مشاهده گردیده اند . آلودگی انسان به لارو این انگل ایجاد بیماري اکینوکوکوزیس (هیداتیدوز یا بیماري هیداتید) را می نماید . کرم بالغ اکینوکوکوس در روده باریک میزبان نهایی اکینوکوکوس گرانولوزوس انگلی است از کلاس سستودها به طول 1 تا 6 میلیمتر که گونه هاي مختلف آن بیشتر در سگ سانان شامل سگ ، گرگ و روباه مشاهده
زندگی می کند و تخمهاي زیادي را از طریق پروگلوتیدهاي بالغ خود به داخل روده آزاد می کند که این تخمها از طریق مدفوع میزبان به محیط اطراف پخش می گردند ،
چنانچه این تخمها توسط میزبان واسط مناسب بلعیده شوند ، در داخل روده باریک این میزبان باز شده و انکسفر از آن خارج می گردد که این انکسفر دیواره روده را سوراخ
کرده و وارد سیستم گردش خون گردیده و سپس در یکی از ارگانهاي بدن میزبان واسط (بویژه کبد و ششها) جایگزین می گردد و در آنجا ایجاد کیست می نماید . معمولاً
آلودگی به این انگل براي سالها بدون علائم بالینی بوده و تنها در زمانیکه کیست بزرگ شده و به عضو مورد تهاجم فشار می آورد مشخص می گردد ، در اکثر موارد
کیست در کبد و ششهاي میزبان واسط ایجاد میگردد ولی به ندرت در مغز ، استخوان ، قلب و سایر ارگانها نیز بوجود می آید . از نظر پراکندگی اکینوکوکوس گرانولوزوس
تقریباً در تمامی دنیا مشاهده می گردد ولی فراوانی آن در مناطقی که سگها از لاشه هاي آلوده تغذیه می کنند بیشتر است . اگر چه عفونت انسان به لارو این انگل به
ندرت اتفاق می افتد ، ولی ابتلا انسان به این لارو با ایجاد کیست یا تومور انگلی در ارگانها همراه میباشد که در صورت عدم درمان می تواند کشنده باشد . تا کنون
روشهاي مختلف سرولوژي جهت تشخیص بیماري هیداتیدوز شامل IFA ، IHA و ELISA ابداع گردیده اند که در آن میان تست الایزا از حساسیت و اختصاصیت
مناسبی برخوردار می باشد ، البته پاسخ ایمنی بدن نسبت به این انگل به مسائل دیگري از جمله محل ایجاد کیست و اندازه آن نیز بستگی دارد، به نظر می رسد که ایجاد
کیست در استخوان و کبد نسبت به ششها ، طحال و مغز با ایجاد آنتی بادي قابل سنجش بیشتري همراه است ، در ضمن مشاهده گردیده است که پارگی و ترکیدن
کیست باعث تحریک ناگهانی سیستم ایمنی در ترشح آنتی بادي می گردد .
اساس آزمایش :
در این تست آنتی ژنهاي خالص شده اکینوکوکوس به داخل چاهکها متصل گردیده است (Coating (، در خلال آزمایش نمونه هاي رقیق شده داخل چاهکها ریخته
می شوند در صورت وجود آنتی بادي علیه آنتی ژنهاي اکینوکوکوس، این آنتی بادي ها به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می گردند با افزودن آنتی بادي ضد IgG
انسانی که به آنزیم HRP متصل شده در صورت وجود آنتی بادي هاي ضد اکینوکوکوس از نوع IgG آنتی هیومن IgG نیز به آنها متصل می گردد ، پس از شستشو ،
محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می شود که شدت رنگ آبی پدید آمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب است ، افزودن محلول متوقف کننده رنگ
آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت تعبیه شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره لاتهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد عوامل بیماریزا می باشند ، جهت
احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط -8 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد.
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط -8 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه می تواند براي مدت یک هفته در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي
نگهداري بیش از مدت یک هفته باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را در وسط و ته چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
8) به دلیل مشابه در بند 7 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي پوشش داده شده (Wells Coated (مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و
درب آن را ببندید .
2) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 101 رقیق کنید ( 10 میکرولیتر نمونه با 1 میلی لیتر محلول رقیق کننده نمونه) .
توجه : کنترلهاي کیت آماده مصرف بوده نیازي به رقیق سازي ندارند .
3) 100 میکرولیتر از کنترلها و نمونه هاي رقیق شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید :
 چاهک اول را به عنوان بلانک انتخاب نموده و در آن چیزي نریزید .
 براي کنترل منفی دو چاهک و براي کنترل مثبت یک چاهک را در نظر بگیرید .
 سایر چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید .
4) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ، چاهکها را براي مدت 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید . (براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان
از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ،
در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو
چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه را داخل کلیه چاهکها به استثناي چاهک بلانک بریزید .

7) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت چاهکها را به مدت 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه نمایید .
8) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 5) .
9) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
10) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
11) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر
چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید و جذب نوري تمامی چاهکها را در مقابل بلانک قرائت نمایید . (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان
فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
ارزشیابی آزمایش :
 جذب نوري کمتر از 0/1 براي بلانک ، در صورت بیشتر بودن جذب نوري بلانک احتمالاً محلول رنگزا آلوده شده است . این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
در موارد زیر باید جذب نوري بلانک از جذب نوري کنترلهاي ذکر شده کم شود .
 میانگین جذب نوري کمتر از 0/2 براي کنترل منفی ، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است ، آزمایش را دوباره
 میانگین جذب نوري بیشتر از 0/6 براي کنترل مثبت . کمتر بودن از 0/6 بیانگر خراب شدن معرف یا کنترل است ، تاریخ انقضاء کیت و کنترل را بررسی کنید . انجام داده و در مراحل شستشو دقت کنید .
محاسبه نتایج :
1) جذب نوري کنترل ها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
2) جهت محاسبه off – Cut از فرمول زیر استفاده نمایید (جذب نوري بلانک را باید از جذب نوري همه نمونه ها و کنترلها کم نمود) .
میانگین جذب نوري کنترل هاي منفی + 0/25 = off-Cut
 نمونه هایی که جذب نوري %10 بالاتر از off-cut دارند از جهت داشتن IgG اختصاصی ضد اکینوکوکوس مثبت تلقی می شوند .
 نمونه هایی که جذب نوري %10 کمتر از off-cut دارند از جهت داشتن IgG اختصاصی ضد اکینوکوکوس منفی تلقی می شوند .
 نمونه هایی که جذب نوري آنها در فاصله %10 پائین تر از off-cut تا %10 بالاتر از off-cut قرار دارد از جهت داشتن IgG اختصاصی ضد اکینوکوکوس مشکوك
تلقی شده و باید به فاصله 2 تا 4 هفته بعد دوباره تست را بر روي نمونه سرم و یا پلاسماي تازه تکرار نمود که چنانچه جذب نوري نمونه مجددا˝ً در فاصله ذکر
شده باقی بماند از جهت داشتن IgG اختصاصی ضد اکینوکوکوس منفی تلقی می شود .
شاخص هاي اجرایی :
1) حساسیت و اختصاصیت :
تعداد 36 نمونه مشکوك به عفونت اکینوکوکوس که متعلق به افراد داراي علایم و نشانه هاي مرتبط با کیست هیداتید بودند مورد بررسی قرار گرفتند . از این تعداد نمونه
الایزاي تجاري مورد مقایسه قرار گرفتند . ، 11عدد آنها با کیت الایزاي تجاري به صورت مثبت تایید گردید و 25 عدد از نمونه ها منفی شدند . بنابراین نتایج به دست آمده از کیت الایزاي پیشتاز طب با کیت
حساسیت نسبی : 91 % = 100 × 10/11
اختصاصیت نسبی : 96 % = 100 × 24/25
صحت نسبی : 94 % = 100 × 34/36
کیت الایزاي پیشتاز طب
کیت الایزاي تجاري
مثبت منفی مجموع نمونه ها
مجموع 36 – 1 24 25 + 10 1 11

2) تست همبستگی :
تعداد 175 نمونه سرم با کیت الایزاي پیشتاز طب و کیت الایزاي مرجع تست شدند . از کل نمونه ها با هر دو روش تعداد 5 نمونه سرم مثبت و 167 نمونه سرم منفی
شدند (98 درصد توافق بین دو روش) .
3) تکرار پذیري :
بصورت محاسبه نتایج به دست آمده از تست کنترل منفی و کنترل مثبت در روزهاي مختلف می باشد . در این ارتباط ضریب تغییرات به دست آمده براي OD ها در
طول موج450 نانومتر بین-10 3 درصد مشخص گردید .
جدول شماره 1 (اینترا- اسی) :

CV
میانگین SD) %(
تعداد دفعات تکرار تست OD
کنترل منفی 24 0/06 0/004 6/6
کنترل مثبت 24 2/35 0/074 3/1
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :

CV
میانگین SD) %(
تعداد دفعات تکرار تست OD
کنترل منفی 10 0/07 0/0069 9/8
کنترل مثبت 10 2/41 0/108 4/5

هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
References :
Schantz, P. and B. Gottstein. “Echinococcosis (Hydatidosis).” Immunodiagnosis of Parasitic Diseases, Vol. 1, Helminthic Diseases . Ed. Walls and Schantz. Academic Press, 1986. pp. 69-107
Krogstad D., G. Visvesvara R. Walls , J. Smith. “Tissue Helminths.” Manual of Clinical Microbiology, 4th Ed. American Society for
Microbiology, Washington, DC. 1985, pp. 657-659
Kagan, I. “Serodiagnosis of Parasitic Diseases.” Manual of Clinical Laboratory Immunology. 3rd Ed. American Society for
Microbiology , Washington, DC. 1986, p. 472
Ashes, L. and T. Orihel. “Parasites – A Guide to Laboratory Procedures and Identification.” 1987, ASCP Press, pp. 176-177
Coltorti, E. “Standardization and Evaluation of an Enzyme Immunoassay as a Screening Test for the Seroepidemiology of Human
Hydatidosis.” Am J Trop Med Hyg #35(5), 1986, pp. 1000-1005
Coltorti, E. et. al. “Field Evaluation of an Enzyme Immunoassay for Detection of Asymptomatic Patients in a Hydatid Control
Program.” Am J Trop Med Hyg, #38(3), 1988, pp. 603-607

روش انجام آزمایش Echinococcus بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژنهاي اکینوکوك
کنترل ها – 100 میکرولیتر – محلول ها بلانک کنترل ها نمونه
نمونه رقیق شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را
برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
کنژوگه آماده مصرف – 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را
برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت
کنید .