کیت الایزا Ferritin

کیت سنجش Ferritin به روش الایزا
مقدمه :
مولکول فریتین با وزن ملکولی 450 کیلو دالتون مهمترین پروتئین ذخیره کننده آهن بدن می باشدکه در بافتهاي مختلف بدن از جمله کبد، طحال و مغز استخوان وجود
دارد. این مولکول داراي 24 زیر واحد پروتئینی است که یک پوسته تقریباً کروي را تشکیل داده و در مرکز آن حفره خالی ایجاد شده توسط حداقل 4000 اتم آهن در
حالت محلول ، غیر سمی و قابل دسترس اتصال می یابد. این میزان آهن حدود %1 از آهن پلاسما را در بر می گیرد. آهن موجود در فریتین مهمترین و اختصاصی ترین
فرم آهن ذخیره اي در سلولهاست که در هنگام کمبود آهن به تدریج آزاد می شود. میزان فریتین در بدو تولد بالا بوده و به تدریج کاهش می یابد و در دوران کودکی در
همان سطح باقی می ماند، پس از بلوغ میزان آن شروع به افزایش می کند و در آقایان بیشتر از خانم ها خواهد بود. میزان فریتین سرم یک پارامتر واقعی از میزان آهن
ذخیره است و با آن ارتباط مستقیم دارد، میزان فریتین در طی بیوریتم ثابت است در حالیکه میزان آهن دستخوش تغییرات گسترده می شود، بنابراین اندازه گیري فریتین
در سرم انعکاسی از میزان آهن در بدن است بطوریکه به موازات کاهش آهن در فقر آهن، کاهش و در بیماري انباشتگی آهن، افزایش می یابد. اندازه گیري فریتین در
تشخیص بیماري کم خونی ناشی از فقر آهن و کنترل درمان شاخص بسیار دقیق و حساسی است و در شرایط پر خطر نظیر بارداري، دیالیز و دهندگان حرفه اي خون
توصیه می شود، میزان فریتین در برخی از بیماریها نظیر همو کروماتوز ، آنمی ناشی از بیماریهاي مزمن، آنمی همولیتیک نظیر تالاسمی، بیماریهاي کبدي، بدخیمی ها و
التهابات افزایش می یابد .
اساس آزمایش:
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی برعلیه یک شاخص آنتی ژنیک Ferritin
پوشش داده می شوند (Coating(. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود. پس از انکوباسیون و شستشو، آنتی بادي ثانویه
ضد Ferritin متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه شده و انکوبه میگردد که مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت Ferritin در نمونه ها متناسب
کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است، با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد . است. پس از شستشو محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است به داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده متناسب با
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد فریتین (Plate Coated Ferritin – Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3) سري استانداردها (Set Standard (: شامل 7 ویال استاندارد با غلظتهاي 0 10، 25، 100، 200، 400، و 800 ml/ng فریتین کالیبره شده در مقابل 3 WHO
rd IS
94/572 (استاندارد صفر محتوي2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترلهاي بالا و پایین : دو ویال هر یک حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب هر ویال .
5) محلول اسی بافر (Buffer Assay (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
7) محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت
1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop(: یک ویال حاوي 12میلی لیتر .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر و در صورت امکان 630 نانومتر .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرو لیتري دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان:
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت تعبیه شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .

3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت
احتیاط بهتر است هر پرسنلی که با کیت کار می کند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاء نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 2-8 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می
باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن ازخون استفاده نمود، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(ماکزیمم تا 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق رسانده و بخوبی تکان دهید تا کاملاً یکنواخت شوند .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حد اکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7) به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100میکرولیتر از محلول اسی بافر (Buffer Assay (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن بخوبی مخلوط
شوند درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
4) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بزنید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
5) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به
مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
6) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 4) .
7) 100 میکرولیتر محلول رنگزا ( Substrate-Chromogen (: به هر چاهک اضافه نمایید .
8) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
9) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري از دستگاه
الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .

محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل
نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید . نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را
نشان خواهد داد .
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال Ferritin درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده بقرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر طبیعی
خود را بدست آورد :

دوده طبیعی برحسب واحد (ml/ng(
آقایان 300 – 20
خانمها قبل از یائسگی 100 – 10
خانمهاي یائسه 200 – 20
نوزادان 500 – 15
شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت Ferritin قابل تشخیص در این کیت ml/ng 1 می باشد .
2) دقت آزمایش :
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف Ferritin انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است : آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشهاي
جذب نوري استانداردها ml/ng
0 0/014
10 0/072
25 0/175
100 0/730
200 1/336
400 2/062
800 2/573

جدول شماره 1 (اینترا-اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین( ml/ng (SD CV %
3/6 0/6 16/5 24 1
3/2 11/7 365 24 2
5/5 32 585 24 3
جدول شماره 2 (اینتر-اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین( ml/ng (SD CV %
5/9 1/2 20/3 10 1
5 18/7 372 10 2
9/3 52/6 566 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از Ferritin به 4 سرم با غلظتهاي مشخص Ferritin افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدارFerritin موجود در سرم نمونه
(ng/ml)
مقدارافزوده شدهFerritin
(ng/ml)
مقدار مورد انتظار
(ng/ml)
مقدار بدست آمده
(ng/ml)
ریکاوري (%)
95 10/5 11 10 12 1
96 54 56 100 12 1
97 250 256 500 12 1
107 29 27 10 44 2
103 74 72 100 44 2
103 280 272 500 44 2
96 78 81 10 152 3
103 130 126 100 152 3
98 321 326 500 152 3
103 219 213 10 416 4
98 253 258 100 416 4
102 469 458 500 416 4
۴) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 4 سرم با غلظت مشخص از Ferritin تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده شده
است .
مقدار Ferritin موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(ng/ml)
ریکاوري (%)
رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16
91 101 98 106 550 1
83 96 101 112 370 2
97 95 105 109 200 3
90 103 101 98 94 4

اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش Ferritin جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا ml/µg 250 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References :
1-Cook J.D، Lipschitz D.A، Miles L.E.M and Finch CA. Serum Ferritin as a measure of iron stores in normal subject.
Am J clin nutr، 1974; 27: 681
2-Beard J.L. Iron Biology in immune function muscle metabolism and neuronal functioing. J Nutr، 2001 ; 131 : 5685-5805
3-Dawson، DW et al. The accuracy and chemichal interpretation of serum ferritin assay. Clin Lab Haematol 1992; 14(1); 47-52
4-Powell، LW. et al. Diagnosis of hemochromatosis. Ann int med، 1998; 129: 925-31
روش انجام آزمایش Ferritin بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد Ferritin
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
اسی بافر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص
پلیت بپوشانید. 30 دقیقه در دماي اتاق ( c° 22-28 ( انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید و طبق دستور
شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید. 30 دقیقه در دماي اتاق ( c° 22-28 ( انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات
چاهکها را خالی کنیدو طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید.
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .