کیت الایزا H.pylori IgG

کیت سنجش آنتی بادي ضد هلیکو باکتر پیلوري از نوع IgG به روش الایزا
مقدمه :
هلیکوباکترپیلوري یک باکتري گرم منفی است که اولین بار در سال 1983 توسط مارشال و وارن در موکوس معده یافت گردید. امروزه این باکتري به عنوان یکی از
عوامل اصلی در ارتباط با بیماریهاي گوناگون در دستگاه گوارش نظیر گاستریت، زخم معده و اثنی عشر ، دیس پپسی غیر زخمی و آدنوکارسینوم معده مطرح می باشد.
فراوانی هیلوباکترپیلوري رابطه مستقیمی با شرایط اجتماعی- اقتصادي جامعه دارد و در کشورهاي در حال توسعه فراوانی عفونت با این باکتري بیشتر از کشورهاي توسعه
هلیکوباکترپیلوري باعث تحریک پاسخ ایمنی شده و در این پاسخ ایمنی آنتی بادیهاي اختصاصی علیه باکتري که از انواع IgG , IgM و IgA می باشند در بدن بوجود می یافته است . فراوانی باکتري در افراد علامت دار تا 90 درصد می رسد در حالیکه این باکتري در حدود 50 درصد از افراد فاقد علائم بالینی نیز کلونیزه می شود. آلودگی به
آید. تست هاي تشخیصی این باکتري شامل تست هاي تهاجمی (آندوسکوپی و برداشت بیوپسی جهت کشت ، هیستوپاتولوژي، تست اوره آز سریع و PCR (و تست هاي
غیر تهاجمی (تست اوره تنفسی و الایزا) می باشد که روش الایزا به دلیل اختصاصیت و حساسیت بالا و آسانی در انجام تست به عنوان یک تست غربالگري در تشخیص
مورد استفاده گسترده قرار گرفته است اما باید توجه داشت که مثبت شدن تست سنجش آنتی بادي ضد هیلوباکترپیلوري به روش الایزا دلیلی بر وجود باکتري در معده و یا
بیماري فعال نمی باشد و باید تست هاي تائیدي دیگر نیز انجام شود. کیت حاضرقابلیت اندازه گیري آنتی بادي ضد هیلوباکترپیلوري از نوع IgG را با اختصاصیت و
حساسیت بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
در این کیت آنتی ژنهاي هلیکوباکترپیلوري به داخل چاهک ها متصل گردیده اند (coating (و در طی آزمایش نمونه هاي رقیق شده داخل چاهکها ریخته می شوند. در
صورت وجود آنتی بادي علیه آنتی ژنها ي هلیکوباکترپیلوري این آنتی بادیها به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می گردند و با افزودن آنتی بادي ضد IgG که به آنزیم
HRP متصل شده، در صورت وجودآنتی بادي هاي ضد هلیکوباکترپیلوري از نوع IgG، آنتی- هیومن IgG متصل به آنزیم HRP نیز به آنها متصل می گردد و پس از
شستشو، محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدیدآمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب است افزودن محلول متوقف کننده رنگ
آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانو متر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي pylori.H) plate coated pylori.H (.
2) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: دو ویال هر یک حاوي 50 میلی لیتر محلول جهت رقیق کردن نمونه ها .
3) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی بادي ضد IgG انسانی متصل شده به آنزیم پراکسیداز (آماده مصرف) .
4) سري استاندارد (set Standards (: 6 ویال استاندارد شامل غلظت هاي ،0 5 ، 10 20، ، 50 و100 ml/U از آنتی بادي ضد هلیکوباکترپیلوري از نوع IgG) هر ویال
استاندارد حاوي 1/5 میلی لیتر می باشد) .
5) سرم کنترل هاي بالا و پایین : دو ویال هر یک حاوي 1/5 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب هر ویال .
6) محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ ( X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت
1/20 رقیق نمایید .
7) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلرهاي 10و100 میکرولیتري دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید.

3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HbsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند. جهت
احتیاط بهتر است هر آزمایشگري که با کیت کار می کند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 2-8 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود. نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(ماکزیمم تا 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از thaw-freez نمودن نمونه پرهیز شود) .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي پوشش داده شده (Wells Coated (مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و
درب آن را ببندید .
2) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 101 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 1 میلی لیتر محلول رقیق کننده نمونه) .
توجه : استانداردهاي کیت آماده مصرف بوده، نیازي به رقیق سازي ندارند .
3) 100میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه هاي رقیق شده را به داخل هر چاهک بریزید. پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه هاي رقیق شده به صورت
داپلیکیت استفاده شود بدین معنی که هر استاندارد و نمونه رقیق شده را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
4) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت، چاهکها را براي مدت نیم ساعت در دماي اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه کنید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد در
هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو
چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی محلول شستشو خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف (Conjugate Enzyme (را به داخل هر چاهک بریزید .
7) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت چاهکها را به مدت نیم ساعت در دماي اتاق (28– 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
8) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 5) .
9) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (در هر چاهک بریزید .
10) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
11) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري هر چاهک
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید. (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .

ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
 میانگین جذب نوري کمتر از 0/1 براي استاندارد صفر ، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است، آزمایش را دوباره
انجام داده و در مراحل شستشو دقت کنید .
 میانگین جذب نوري بیشتر از 1 براي استاندارد ،100 کمتر بودن این جذب نوري، بیانگر خراب شدن استاندارد و یا کیت است، تاریخ انقضاء کیت و استاندارد را بررسی  میانگین جذب نوري استاندارد 5 باید بیشتر از استاندارد صفر باشد .
کنید .
محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها وغلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد به دست آورید، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل
نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را به دست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه
این خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید ، نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را
نشان خواهد داد.
مطالعه بر روي یک جمعیت نرمال مقدار off-cut معادل استاندارد 10را براي افتراق بین افراد با تیتر مثبت آنتی بادي از منفی به اثبات رسانید و افرادي که تیتر آنتی بادي
آنها ما بین ml/U 5 و ml/U 10 می باشد مشکوك تلقی شده و پس از مدتی باید این بیماران با استفاده از سرم و یا پلاسماي تازه ، دوباره تست شوند .
نمونه جذب نوري استاندارد ها و نمودار حاصله :
Standard curve
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 20 40 60 80 100 Standard Concentration
OD
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت و اختصاصیت آزمایش :
مجموعا تعداد 187 بیمار که با علائم و نشانه هاي بیماري هاي متعددي به پزشکان مراجعه کرده بودند مورد بررسی قرار گرفتند . توسط یا فته هاي بیوپسی
(استفاده از روش هاي بافت شناسی ،کشت و تست CLO (104 نفر از این تعداد بصورت هلیکوباکتر پیلوري مثبت و 83 نفر نیز بصورت هلیکوباکتر پیلوري منفی
مورد تایید قرار گرفتند . در جدول صفحه بعد نتایج تست الایزا با یافته هاي نمونه هاي بیوپسی آندوسکوپی مورد مقایسه قرار گرفتند:
جذب نوري استانداردها (ml/U(
0 0/03
5 0/045
10 0/75
20 1/2
50 1/9
100 2/3

کیت الایزاي IgG pylori.H پیشتازطب
% 97 = 104 / 101 = حساسیت
% 91 = 83 / 76 = اختصاصیت
% 95 = 187 177/ = صحت
2) تست مقایسه اي :
تعداد 249 سرم بیمار بوسیله کیت الایزاي IgG pylori.H پیشتازطب و یک کیت تجاري داراي تاییدیه اتحادیه اروپا تست شدندکه از این تعداد، 121 نمونه سرم
مثبت و 109 نمونه سرم با هر دو کیت منفی بودند . (% 92 همبستگی)
H.pylori IgG الایزاي کیت
پیشتازطب
کیت تجاري معتبر
مجموع – +
+ 121 5 126
– 14 109 123
249 114 135 مجموع
3)تست تکرارپذیري:
سه نمونه سرم با غلظت هاي مختلف IgG pylori.H جھت تست تکرار پذیری مورد استفاده قرار گرفتند کھ نتایج بھ دست آمده در جداول ذیل
آمده است :
جدول شماره ١ : ( اینترا- اسی )
CV% SD
U/ml
میانگین
نمونه تعداد تست هاي انجام شده ml/U
4/6 0/3 6/5 24 1
5/0 0/9 18 24 2
4/4 2/0 45 24 3
جدول شماره :٢ ( اینتر- اسی )
هر نمونه بصورت دوپلیکیت(دوتایی) تست شده است.
مجموع – مشکوك +
+ 101 1 2 104
– 5 2 76 83
187 مجموع کل نمونه ها
CV% SD
U/ml
میانگین
نمونه تعداد تست هاي انجام شده ml/U
8/1 0/71 8/7 10 1
9/4 1/76 18/8 10 2
6/7 2/90 43/5 10 3
بیوپسی

References :
1. Peter W.L. (1991)- H.pylori and peptic ulcer disease. N. Engl. j. Med. 324: 1043-1047
2. M. C. Guigan. J.E. (1988) Peptic ulcer and gastritis. Harrison’s principles of internal medicine. 12th edition, chapter
238, 1229-1248
3. Padolsky I. (1989)- Prevalence of H.pylori in healthy subject and patients with peptic disease. Gasteroentrology, 96;
(suppl. A) 394.
4. C.L. Perez and M.O. Blaser (1991)- Serodiagnosis of -H.pylori: comparison of enzyme linked immuno sorbent assay.
J. Clin. Microbiol. 29: 1635-1639.
روش انجام آزمایش IgG pylori.H بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژنهاي هلیکو باکتر پیلوري
سرم کنترل – 100 میکرو لیتر – استانداردها 100 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه رقیق شده
نمونه رقیق شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر
(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .