کیت الایزا H.pylori IgM

کیت سنجش آنتی بادي ضد هلیکو باکتر پیلوري از نوع IgM به روش الایزا
مقدمه :
هلیکوباکترپیلوري یک باکتري مارپیچی شکل گرم منفی است که در لایه موکوزاي معده یافت می شود، مطالعات مختلف ارتباط بین وجود هلیکو باکتر پیلوري با بیماریهاي
مختلف دستگاه گوارش از جمله گاستریت مزمن، زخم معده، زخم اثنی عشر و آدنوکارسینوم معده را نشان داده است. این باکتري در 95-98 درصد از بیماران مبتلا به زخم
حدود %90 می رسد، در حالیکه تعداد زیادي از بیماران (بیش از %50 در سنین بالاي 50 سال) فقط توسط باکتري کلونیزه شده و تا آخر عمر علائم بالینی را نشان نمی اثنی عشر و 60-90 درصد از مبتلایان به زخم معده وجود دارد، میزان شیوع عفونت با استفاده از روشهاي باکتریولوژي، بافت شناسی و سرولوژي در افراد با علائم بالینی به
دهند . باید توجه داشت که وجود شواهدي همانند وجودآنتی بادي اختصاصی، تست مثبت اوره تنفسی و کشت یا بیوپسی مثبت بدون وجود علائم بالینی می توانند فقط دال
بر کلونیزاسیون باکتري باشند ولی چنانچه علائم بالینی نیز وجود داشته باشد دلیل بر عفونت خواهد بود. دو نوع روش تهاجمی و غیر تهاجمی براي تشخیص هلیکوباکتر
پیلوري وجود دارد، روش تهاجمی با استفاده از آندوسکوپی و برداشت بیوپسی جهت کشت ، هیستوپاتولوژي و تست اوره آز سریع انجام می شود که علاوه بر گران بودن
براي بیمار ناخوشایند نیز می باشد، روشهاي غیر تهاجمی شامل تست اوره تنفسی و روشهاي سرولوژیک است، وجود آنتی بادي اختصاصی از کلاس IgM علیه باکتري در
سرم یک شاخص تشخیص ابتلاي اولیه به باکتري است و الایزا تکنیک انتخابی براي تشخیص این آنتی بادي ها می باشد .
اساس آزمایش :
در این کیت آنتی ژنهاي هلیکوباکترپیلوري به داخل چاهک ها متصل گردیده اند (coating (و در خلال آزمایش نمونه هاي رقیق شده به داخل چاهکها ریخته می شوند.
در صورت وجود آنتی بادي علیه آنتی ژنهاي هلیکوباکترپیلوري این آنتی بادیها به آنتی ژنهاي کف چاهکها متصل میگردند و با افزودن آنتی بادي ضد IgM که به آنزیم
HRP متصل شده در صورت وجود آنتی بادي هاي ضد هلیکوباکترپیلوري از نوع IgM آنتی هیومن IgM متصل به آنزیم HRP نیز به آنها متصل میگردد و پس از شستشو
، محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب است، افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی را به
زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت کوت شده (plate Coated (: یک پلیت 96 تستی حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي هلیکو باکتر پیلوري .
2) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: 1 ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول جهت رقیق کردن نمونه ها .
3) محلول اسی بافر (Buffer Assay (: 1 ویال حاوي 7/5 میلی لیتر محلول IgG human Anti جهت مهار کردن روماتویید فاکتور و غلظتهاي بالاي IgG در نمونه ها .
4) محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی بادي ضد IgM انسانی متصل شده به آنزیم پراکسیداز .
5) سرم کنترل مثبت (Control Positive (: یک ویال حاوي 1/5 میلی لیتر محلول بافري، داراي پروتئین به عنوان پایدار کننده و 0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و
سرم انسانی غیر فعال شده، حاوي آنتی بادي IgM علیه Pylori.H .
6) سرم کنترل منفی (Control Negative (: یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول داراي بافر فسفات و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی منفی از نظر
آنتی بادي IgM علیه Pylori.H .
7) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: 1 ویال حاوي 12 میلی لیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه (آماده براي مصرف) .
8) محلول شستشو (Buffer Wash (: دو ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X10 (داراي محلول بافر فسفات و %0/05 تویین . جهت تهیه محلول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/10 رقیق نمایید .
9) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
10) برچسب مخصوص پلیت.
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي دقیق .
3) آب مقطر .
4) دستگاه انکوباتور 37 درجه سانتی گراد .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خوداري نمایید.
3) این کیت صرفا جهت اندازه گیري IgM Pylori.H Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
4) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg ، HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت احتیاط بهتر است کاربرانی
که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/10 رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه را می توان براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر در
دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود. در ضمن باید ازthaw – Freeze نمودن نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است بمحض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود .
آماده سازي اولیه نمونه ها :
الف) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 51 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 500 میکرولیتر محلول رقیق کننده نمونه) .
توجه: کنترلهاي کیت آماده مصرف بوده و نیازي به رقیق سازي ندارند .
ب) 75 میکرولیتر از نمونه هاي رقیق شده را داخل لوله دیگري ریخته و 75 میکرولیتر از محلول اسی بافر به آنها اضافه کنید.سپس به مدت 20 دقیقه در دماي اتاق
نگهداري نمایید ؛ توجه نمایید که نگهداري مدت زمان طولانی تر از 20 دقیقه ممکن است منجربه جذب آنتی بادیهاي اختصاصی علیه pylori.H گردد .
مراحل انجام آزمایش:
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 100 میکرولیتر از کنترل ها و 100 میکرولیتر از نمونه هاي آماده شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید؛ دو چاهک اول را براي بلانک و کنترل مثبت در نظر بگیرید
. کنترل منفی را به صورت دوپلیکیت ریخته و سایر چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید؛ پس از پوشاندن چاهکها توسـط برچسـب مخصـوص پلیـت ، چاهکهـا را بـراي
مدت30 دقیقه در دماي37 درجه سانتی گراد قرار دهید .
3) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله و یا سرنگ استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش
گردد . در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات
شستشو ، چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .

4) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف را به داخل چاهکها به استثناي چاهک بلانک بریزید؛ پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ،
چاهکها را به مدت 30 دقیقه در دماي37 درجه سانتی گراد قرار دهید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 3) .
6) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate – Chromogen (به همه چاهکها اضافه نمایید؛ چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی قرار دهید .
7) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ، واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید؛ براي سنجش جذب نوري هر چاهک از
دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نموده و جذب نوري چاهکها را قرائت نمایید. توصیه میشود از فیلتر nm630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
– جذب نوري کمتر از 0/05 براي بلانک، در صورت بیشتر بودن جذب نوري بلانک احتمالاً محلول رنگزا آلوده شده است .
– جذب نوري کمتر از 0/1 براي کنترل منفی، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري، احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است، آزمایش را دوباره انجام داده و در
مراحل شستشو دقت کنید .
– جذب نوري بیشتر از 0/6 براي کنترل مثبت .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
1) جذب نوري کنترلها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm450 و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm630 بخوانید .
2) جذب نوري بلانک را از کنترلها و نمونه ها کم کنید .
3) مقدار Off Cut را طبق فرمول زیر بدست آورید .
0/2 + میانگین جذبهاي نوري کنترل منفی = value Off Cut
4) براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی، مقدار ایندکس را از تقسیم جذب نوري نمونه بر مقدار off-Cut بدست آورید :
Cut-off Index(COI) = OD of sample/Cut-off value
بر اساس این فرمول مقادیر بالاتر از 1/1 مثبت و پایین تر از 0/9 منفی قلمداد می شوند. نمونه هایی که مقدار ایندکس آنها بین -1/1 0/9 می باشد مشکوك بوده و باید
پس از مدتی با استفاده از سرم یا پلاسماي تازه مجدداً آزمایش شوند .
بررسی نتایج :
جواب منفی نشان دهنده عدم وجود آنتی بادي IgMعلیه Pylori.H می باشد .
جوابهاي مثبت باید مجدداً تکرار شوند . نمونه هاي مثبتی که در تکرار مجدد منفی میشوند، باید منفی گزارش گردند . مثبت شدن آزمایش در مرتبه اول می تواند به سبب
خطاي کاري در مراحل شستشو و یا نمونه برداري باشد .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت : 186عدد سرم مثبت تایید شده با روش T.B.U، کمی لومینسانس والایزاي مرجع با این کیت آزمایش شدند که 185 مورد مثبت بودند. با توجه به نتایج
بدست آمده حساسیت کیت جهت اندازه گیري آنتی بادي IgM علیه Pylori.H ، 99/46 درصد بوده و با کیتها و روشهاي تاییدي معتبر قابل مقایسه می باشد .
2) اختصاصیت : 1435عدد سرم منفی به طور همزمان با این کیت و روش کمی لومینسانس آزمایش شدند که با روش این کیت 1433 نمونه منفی بودند. بر اساس نتایج
بدست آمده اختصاصیت این کیت 99/86 درصد می باشد .
3) دقت آزمایش: جهت بررسی تکرارپذیري کیت ،آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله کنترل منفی
و مثبت و یک نمونه سرمی مثبت ضعیف انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .

– آزمون دقت درون سنجی (assay -Intra (:
کنترل مثبت 20 1/51 0/071 4/7
کنترل منفی 20 0/034 0/0022 6/5
نمونه مثبت ضعیف 1 20 0/244 0/02 8/2
نمونه مثبت ضعیف 2 20 0/314 0/019 6/0
نمونه مثبت ضعیف 3 20 0/417 0/018 4/3
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD %CV – آزمون دقت میان سنجی (assay -Inter (:
کنترل مثبت 10 1/53 0/073 4/8
کنترل منفی 10 0/034 0/0024 7/0
نمونه مثبت ضعیف 1 10 0/25 0/021 8/4
نمونه مثبت ضعیف 2 10 0/33 0/023 7/0
نمونه مثبت ضعیف 3 10 0/43 0/025 5/8
*هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
References:
1. Peter W.L. (1991). H.pylori and peptic ulcer disease. N. Engl. J. Med. 324: 1024-1047
2. M C Guigan J.E. (1988) Peptic ulcer and gastritis. Harrison’s principles of internal medicine. 12th edition, chapter 238,
1229-1248.
3. Podolsky I. (1989). Prevalence of H.pylori in healthy subject and patients with peptic disease. Gasteroentrology 96
(suppl. A): 394.
4. C.I. Perez and M.O. Blaser (1991) Serodiagnosis of H.pylori: comparison of enzyme linked immunosorbent assay. J. Clin.
Microbiol 29: 1635-1639.
روش انجام تست IgM.Pylori.H به صورت شماتیک
* نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 51 رقیق کنید . سپس 75 میکرولیتر از نمونه هاي رقیق شده را با 75 میکرولیتر از محلول
اسی بافر مخلوط کرده و به مدت 20 دقیقه در دماي اتاق قرار دهید .
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژن هاي اختصاصی Pylori.H
کنترل ها – 100 میکرولیتر – محلولها بلانک کنترل ها نمونه آماده شده
نمونه آماده شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با چسب مخصوص پلیت بپوشانید و آن را به مدت 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو ، 5 بار چاهکها را بشویید .
آنزیم کنژوگه – 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با چسب مخصوص پلیت بپوشانید و آن را به مدت 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو ، 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به مدت 15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی قرار دهید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در مقابل بلانک و در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .