کیت الایزا HBs Ab

سنجش HBs- Anti به روش الایزا
مقدمه :
هپاتیت B در اثر عفونت ویروسی (HBV (از خانواده هپادنا ویریده که حاوي ژنوم DNA حلقوي است ایجاد می شود. HBsAg لیپوپروتئین سطح ویروس هپاتیت B می باشد. در
بین آنتی ژنهاي سطحی، شاخص a ) اسید آمینه 147 -124 (هدف مهم در پاسخ ایمنی همورال است. اندازه گیري آنتی بادي علیه این آنتی ژن به عنوان شاخص مصونیت مورد
استفاده قرار می گیرد. از نقطه نظر بیولوژیک پاکسازي ویروس بطور کلاسیک بوسیله ظهور آنتی بادي (HBs-anti (علیه آنتی ژن استرالیایی (Ag HBs (در پروفایل سرولوژیک
مشخص می شود. افرادي که به صورت حامل مزمن ویروس می باشند آنتی ژن ویروس را براي سالها در سرم خود دارند ولی آنتی بادي ضد HBs در آنها ظاهر نمی شود. وجود
آنتی بادي دلیل بر روبرو شدن قبلی با عفونت، بهبودي و یا ایجاد ایمنی علیه هپاتیت B به وسیله واکسیناسیون می باشد. در کسانی که به هپاتیت B مبتلا شده اند HBs-Anti
معمولا˝ در پایان دوره پنجره اي (Period Window (و متعاقب پاك شدن سرم از Ag HBs در خون ظاهر می شود و تیتر آن تا سالها بالا می ماند. عدم تولید HBs-Anti
پس از دوره پنجره اي موید ابتلاي فرد به فرم مزمن بیماري است که این اتفاق تقریبا˝ در 5 %از مبتلایان بوقوع می پیوندد .
اساس آزمایش :
اساس آزمایش در این کیت بر روش Immunoassay Enzyme Sandwich Antigen استوار می باشد. چاهکهاي پلیت با آنتی ژنهاي نوترکیب HBs) زیر نوع هاي ad و
ay (پوشش داده شده اند، در هنگام آزمایش ، پس از افزودن سرم، در صورت وجود آنتی بادیهاي اختصاصی علیه آنتی ژنهاي HBs) IgA-IgG-IgM ،(آنتی بادیها از طریق یک
Fab به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می شوند. پس از انکوباسیون و شستشو ، محلول آنزیم کونژوگه که حاوي آنتی ژنهاي HBs ، نشاندار شده با آنزیم HRP می باشد به
چاهکها اضافه می شود. این آنتی ژنهاي کونژوگه به صورت اختصاصی به Fab آزاد آنتی بادیهاي اتصال یافته به کف چاهک متصل شده و ایجاد کمپلکس می نمایند. پس از
انکوباسیون و شستشو، محلول سوبسترا و کروموژن به چاهکها اضافه می شود. رنگ آبی ایجاد شده بعد از این مرحله نتیجه تجزیه سوبسترا در اثر فعالیت آنزیم و تغییر رنگ
محلول کروموژن ناشی از این واکنش می باشد . شدت این رنگ متناسب با تعداد کمپلکسهاي ایمنی ایجاد شده در چاهکها است. با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد
تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1 (پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي اختصاصی HBs.
2 (محلول آنزیم کونژوگه آماده مصرف (Use To Ready Conjugate Enzyme : (یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی ژن HBs متصل شده به آنزیم پراکسیداز در محلول
بافري حاوي پروتئین و نگهدارنده .
3 (سري استانداردها (set Standards : (5 ویال استاندارد شامل غلظت هاي صفر ، 10 ، 50 ، 100 و ml200/mIU از آنتی بادي ضد HBs کالیبره شده در برابر استاندارد
WHO) هر ویال استاندارد حاوي 5/1 میلی لیتر می باشد) .
4 (سرم کنترل (Serum Control : (یک ویال حاوي 5/1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5 (محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen : (1 ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده براي مصرف) .
6 (محلول شستشو (Solution Wash : (یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (20X .(جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف، مقدار مورد نیاز را با آب
مقطر به نسبت 20/1رقیق نمایید .
7 (محلول متوقف کننده (Solution Stop : (یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
8 (برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1 (دستگاه الایزاریدر با فیلتر طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان با فیلتر طول موج 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2 (سمپلر 100 میکرولیتر دقیق .
3 (بن ماري یا انکوباتور C° 37.
4 (محلول هیپوکلریت سدیم 5 %یا محلول ضد عفونی کننده دیگر .
5 (آب مقطر .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1 (محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت می باشند .
2 (این کیت صرفا جهت اندازه گیري HBs-Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
3 (از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4 (کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود آنتی ژنهاي HBs وHIV و آنتی بادیهاي HIV و HCV کنترل گردیده و فاقد این عوامل میباشند (غیر فعال سازي
سرم یا پلاسما بمدت نیم ساعت در 56 درجه سانتی گراد انجام گرفته است) . جهت احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
5 (هنگام انجام آزمایش حتماً از دستکشهاي یکبار مصرف استفاده کنید. همچنین استفاده از عینکهاي آزمایشگاهی هنگام کار با سرمهاي بیماران توصیه می شود .
6 (سرمهاي مثبت از نظر آنتی بادیهاي ضد HBs ،وسایل و محلولهاي wash مشکوك به آلودگی را بعد از اتمام کار حداقل به مدت 30 دقیقه درون محلول هیپوکلریت سدیم
5 %یا محلولهاي مناسب ضد عفونی کننده دیگر قراردهید . همچنین اتوکلاو کردن ، به مدت 15 دقیقه در C°121 پیشنهاد می گردد .
شرایط نگهداري :
1 (کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2 (چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید. پایداري پلیت بعد از باز کردن آن 4 ماه میباشد .
3 (پایداري محتویات کیت (قبل از باز شدن درب کیت) تا پایان مدت انقضاء نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد . توصیه میشود بعد از باز کردن کیت حداکثر در فاصله
زمانی 4 ماه از آن استفاده نمایید .
4 (محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 20/1 رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسماي EDTA دار را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود. از سرم یا پلاسماي رقیق شده یا مخلوط شده با نمونه هاي دیگر نباید استفاده کرد. نمونه را می
توان به مدت یک هفته در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر در دماي 20 -درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از thaw-Freez نمودن
نمونه پرهیز شود). از نمونه هاي مشکوك به آلودگی میکروبی جهت انجام تست استفاده نشود .
توضیحات عمومی :
1 (قبل از شروع مراحل آزمایش، تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید. جهت ماندگاري بهتر پلیت، مانند دیگر اجزاء کیت، پلیت را بعد از رسیدن به دماي محیط از
کیسه مخصوص آن خارج کرده و چاهکهاي مورد نیاز را بردارید .
2 (بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3 (از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4 (پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5 (براي کسب نتایج مطلوب، باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6 (از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را آماده
نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج مطلوب تري می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1 (تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2 (100 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را به ترتیب داخل چاهک ها بریزید، پیشنهاد میگردد که از استانداردها و نمونه ها به صورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بربزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3 (درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و سپس به مدت 60 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید .

4 (محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از سمپلر
8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد. در هر دفعه
شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت
وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .
5 (100 میکرولیتر از محلول آنزیم کونژوگه را داخل کلیه چاهکها اضافه نمایید .
6 (پس از پوشاندن چاهکها توسط بر چسب مخصوص پلیت چاهکها را به مدت 30 دقیقه در37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید .
7 (محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 4. (
8 (100 میکرولیتر محلول سوبسترا- رنگزا به همه چاهکها اضافه نمایید و به مدت 15 دقیقه در دماي اتاق و تاریکی انکوبه نمایید .
9 (با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري هر چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر
450nm استفاده نمایید و جذب نوري تمامی چاهکها را در مقابل بلانک قرائت نمایید (توصیه می شود از فیلتر 630nm بعنوان فیلتر رفرانس استفاده شود) .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ازرشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
جذب نوري کمتر از 1/0 براي استاندارد صفر، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است، آزمایش را دوباره انجام داده و در مراحل
شستشو دقت کنید. جذب نوري استاندارد 10 باید بیشتر از استاندارد صفر باشد. جذب نوري بیشتر از 1 براي استاندارد 200 ضروري است. جذب نوري کمتر از 1 بیانگر خراب شدن
استاندارد و یا کونژوگه است. تاریخ انقضاء کیت و استاندارد ها را بررسی کنید .
محاسبه نتایج :
1 (جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج 450nm و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس 630nm بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
2 (با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها وغلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي (Y (و
غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد به دست آورید نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا منحنی استاندارد
رسم شود. میانگین جذب نوري براي هر نمونه را به دست آورده و روي محور عمودي محل آن را پیدا کنید. نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه خط بر
محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی، خط عمودي بر محور افقی رسم نمایید . نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان خواهد داد .

توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
بررسی نتایج :
نتایج به دست آمده از این سنجش باید بر اساس علائم بالینی ، تاریخچه پزشکی بیمار و نتایج سایر روشها تفسیر شود. مقادیر بیشتر از ml/10mIU نشان دهنده این است که آنتی
بادي اختصاصی علیه آنتی ژنهاي سطحی HBV در حد قابل تشخیص وجود دارد. مقادیر کمتر ازml/mIU 10 نشان دهنده این است که آنتی بادي اختصاصی علیه آنتی ژنهاي
سطحی HBV در حد قابل تشخیص وجود ندارد .
شاخصهاي اجرایی :
1 (حساسیت : جهت بررسی حساسیت کیت ، تعداد 174 نمونه که قبلا” با 2 کیت تجاري (داراي نشان CE (مورد آزمایش قرار گرفته و مثبت بودند، با این کیت نیز آزمایش
شده و مثبت بودند. به علاوه پانل BBI با مشخصات PHG203 Panel Performance Titer Mixed HBs/HBc-Anti مورد ارزیابی قرار گرفت. این پانل حاوي 15 نمونه
بود که با استفاده از این کیت نیز نتایج زیر به دست آمد :

3
بر اساس آزمایشات انجام شده حساسیت کیت برابر 100 %با ضریب اطمینان 5/99 %می باشد .
2 (اختصاصیت : جهت بررسی اختصاصیت کیت، تعداد 548 نمونه سرم و پلاسماي منفی که با 2 کیت تجاري داراي نشان CE ،مورد آزمایش قرار گرفته بودند با این کیت
نیز آزمایش شده و منفی بودند . بدین ترتیب اختصاصیت کیت برابر 100 %می باشد .
3 (دقت آزمایش : جهت بررسی تکرار پذیري کیت ، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) با استفاده از 3 نمونه
سرم با غلظتهاي مختلف HBs-Anti انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (ml/mIU (SD% CV – آزمون دقت میان سنجی (assay-Inter: (
9/1 0/3 3/3 20 1
5/1 0/7 13/7 20 2
3/7 5/4 145 20 3
DiaSorin Anti- HBs
KIT
BBI
S/Co
Abbott Anti- HBs
KIT
BBI
S/Co
PT Anti- HBs
KIT
S/Co
Sample
ID
DiaSorin Anti- HBs KIT
BBI
S/Co
Abbott Anti- HBs KIT
BBI
S/Co
PT Anti- HBs
KIT
S/Co
Sample
ID
1 2.3 1.9 0.3 9 9 9.7 5.6
2 20 20.7 14.3 10 10.7 30.6 10.9
3 >20 33.3 16.1 11 0.03 0.2 0.0
4 >20 33.3 16.1 12 0.03 0.2 0.0
5 >20 33.3 16.1 13 0.03 0.2 0.0
6 0.03 0.5 0.0 14 0.04 0.2 0.0
7 >20 33.3 10.7 15 0.05 0.1 0.0
8 1.8 4 0.6

آزمون دقت درون سنجی (assay-Intra: (
10 0/3 3 10 1
4/9 0/7 14/3 10 2
4 5/7 143/5 10 3
:References * هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
Tatsuji Kimura, et al. Sensitive Enzyme Immunoassay for Hepatitis B Virus Core-Related Antigens and Their Correlation to Virus Load.
Journal of Clinical Microbiology, Feb. 2002, p. 439–445 Vol.40, No.2
Vincent Thibault, et al. Coexistence of Hepatitis B Surface Antigen (HBs Ag) and Anti-HBs Antibodies in Chronic Hepatitis B Virus
Carriers: Influence of “a” Determinant Variants. Journal of Virology, Mar. 2006, p. 2968–2975 Vol. 80, No. 6
Jia-Horng Kao, et al. Genotypes and Clinical Phenotypes of Hepatitis B Virus in Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection. Journal of Clinical Microbiology, Apr. 2002, p. 1207–1209 Vol. 40, No. 4
Karin Kidd-Ljunggren, et al. Genetic variability in hepatitis B viruses.Journal of General Virology. 2002, p.1267–1280 Vol. 83
Dan Chen et al. Performance of a New-Generation Chemiluminescent Assay for Hepatitis B Surface Antigen.
Clinical Chemistry, 2006, p.1592–1598 Vol.52, No.8
روش انجام آزمایش HBs- Anti بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژن اختصاصی HBV
محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
استاندارد ها 100 میکرولیتر — —
سرم کنترل — 100 میکرولیتر —
نمونه — — 100میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید سپس 60 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد
انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار
چاهکها را بشویید .
آنزیم کونژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید سپس 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد
انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار
چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر
رفرانس) قرائت کنید .