کیت الایزا (hCG (Rapid

کیت سنجش Rapid.hCG به روش الایزا
مقدمه :
hCG هورمون گلیکوپروتئینی است که بصورت طبیعی در دوران بارداري توسط جفت ترشح می شود. با شروع بارداري غلظت آن در خون به سرعت افزایش
گذشت چند روز مقدار آن به شدت کاهش یافته و قابل اندازه گیري نمی باشد. از نظر ساختمانی مولکول کامل hCG داراي دو زیرواحد آلفا و بتا می باشد ، یافته و در اواخر سه ماهه اول به بالاترین میزان خود می رسد. در خلال بارداري مقدار این هورمون در خون بسیار بالا بوده ولی به محض زایمان و بعد از
زنجیره آلفا ساختمان مشابهی با زنجیره آلفاي سایر هورمونهاي گلیکوپروتئینی مانند FSH ,LH و TSH دارد. تفاوتهاي موجود در زیر واحد بتاست که تفاوتهاي
بیولوژیکی و نیز ایمونوشیمیایی این هورمونها را سبب می گردد که این تفاوتهاي ایمونوشیمیایی در تشخیص و اندازه گیري این هورمونها حائز اهمیت فراوان
هستند . برخی آنتی بادي ها توانائی شناسایی سایتهاي خاصی از زنجیره بتا را در مولکول hCG دارند که این سایتها در سایر هورمونهاي گلیکو پروتئینی وجود
ندارند. بنابراین با استفاده از این آنتی بادي ها میتوان سنجش این هورمون را بطور اختصاصی انجام داد. روشهاي اختصاصی سنجش این هورمون امکان
تشخیص بارداري را 8 تا 11 روز پس از لقاح فراهم می سازد. کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون هورمون hCG را با اختصاصیت و حساسیت بسیار
بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
مولکول hCG پوشش داده می شوند (Coating(. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود، پس از انکوباسیون و شستشو ، اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی علیه یک شاخص آنتی ژنیک
آنتی بادي ثانویه ضد hCG متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه می شود. مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت hCG در نمونه ها
متناسب است. پس از شستشوي مرحله دوم محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (و کروموژن است، داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی
پدید آمده متناسب با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها می باشد. با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري
را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) یک پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد hCG) Plate Coated hCG-Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme hCG (: یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
4) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي صفر ، 25 ،100، ،250 500 و1000L/IU ازhCG کالیبره شده بر مبناي WHO
3
rd
75/537 IS) استاندارد صفر حاوي 15 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
5) سرم کنترل (Serum Control (: یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
7) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار
مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده اند .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً˝ خودداري نمایید .

3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ،
به منظور احتیاط توصیه می شود تا کاربرانی که با این کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط -8 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و
مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه را میتوان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت طولانی
تر (حداکثر تا 30 روز) دردماي -20 0درجه سانتی گراد نگهداري کرد. از ذوب و فریز نمودن مکرر نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به دماي اتاق برسانید .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلرهاي یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب میباشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي
مورد نیاز را آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این امر با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7) به دلیل سرعت بالاي واکنشها در این کیت و زمان انکوباسیون کوتاه، توصیه میشود که در هر بار انجام آزمایش بیش از 2 استریپ نمونه را به کار نبرید .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود
بدین معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 5 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
4) چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از
یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر
چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي
یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
5) 50 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نمایید .
6) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 5 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
7) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار بشویید (همانند بند4) .
8) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
9) چاهکها را به مدت 5 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
10) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري
هر چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .

محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي
محور عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را
به یکدیگر وصل نمایید و منحنی را ترسیم نمایید .
3) میانگین جذب نوري هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي محل آن راپیدا کنید، نقطه مذکور را توسط یک خط افقی به منحنی وصل نمایید
بطوریکه این خط بر محور Y کاملاً عمود باشد و سپس از محل تلاقی خط و منحنی خطی عمود بر محور افقی رسم کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی
مقدار غلظت را نشان خواهد داد .

استانداردها
جذب نوري (L/IU(
0 0/021
25 0/101
100 0/395
250 0/921
500 1/495
1000 2/255

.
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر تخمینی hCG درسرم فرد طبیعی در طول مدت بارداري از قرار زیر می باشد :

موجود در سرم(L/IU(
ماه اول 56500 – 0 زمان پس از بارداري مقدار hCG
بین ماه دوم تا سوم 288500 – 7650
سه ماهه دوم 106000 – 3600
سه ماه سوم 117000 – 4200

به صورت تخمینی در خلال شش هفته اول بارداري غلظت سرمی hCG هر دو روز دو برابر می شود، بعد از وضع حمل مقدار hCG بسرعت پایین آمده و بعد
از مدت کوتاهی به پایین ترین حد خود می رسد. مقدار خیلی کمی از hCG در موارد حاملگی هاي خارج رحمی مشاهده می شود. در صورتی که در شرایطی
نظیر نئوپلاسم تروفوبلاستیک و یا غیر تروفوبلاستیک و مول هیداتی فرم می توان غلظتهاي بسیار بالاي hCG را مشاهده نمود .
توجه : جهت تشخیص بارداري، سرمهایی که داراي غلظتhCG L/IU 25 – 10 می باشند باید مشکوك قلمداد شده و سرمهایی که غلظتhCG در آنها
بیش از L/IU 25 باشد مثبت تلقی می شوند، در مورد سرمهاي مشکوك و منفی به منظور حصول اطمینان باید حداقل 48 ساعت بعد نمونه گیري مجدد صورت
گرفته و آزمایش تکرار شود. در صورتیکه غلظت hCG در نمونه بیش از L/IU 1000 باشد جهت بدست آوردن غلظت صحیح می توان سرم را با استاندارد صفر
رقیق نموده و پس از بدست آوردن غلظت نمونه رقیق شده ، عدد حاصل را در ضریب رقت ضرب نمود .
نکته : هر چند طراحی این کیت به گونه اي است که از تاثیر عوامل مداخله گر تا حد امکان جلوگیري شود اما به ندرت امکان دارد بعضی عوامل موجود در
نمونه سرم ، از جمله آنتی بادي هاي هتروفیلیک ، برخی داروها ، اتوآنتی بادي ها و نظایر اینها بر نتیجه آزمایش اثر بگذارند . بنابر این بهتر است تفسیر نتیجه
آزمایش با در نظر گرفتن نتایج معاینات بالینی ، یافته هاي تشخیصی دیگر و شرح حال بیمار انجام گیرد .

به صورت تخمینی در خلال شش هفته اول بارداري غلظت سرمی hCG هر دو روز دو برابر می شود، بعد از وضع حمل مقدار hCG بسرعت پایین آمده و بعد
از مدت کوتاهی به پایین ترین حد خود می رسد. مقدار خیلی کمی از hCG در موارد حاملگی هاي خارج رحمی مشاهده می شود. در صورتی که در شرایطی
نظیر نئوپلاسم تروفوبلاستیک و یا غیر تروفوبلاستیک و مول هیداتی فرم می توان غلظتهاي بسیار بالاي hCG را مشاهده نمود .
توجه : جهت تشخیص بارداري، سرمهایی که داراي غلظتhCG L/IU 25 – 10 می باشند باید مشکوك قلمداد شده و سرمهایی که غلظتhCG در آنها
بیش از L/IU 25 باشد مثبت تلقی می شوند، در مورد سرمهاي مشکوك و منفی به منظور حصول اطمینان باید حداقل 48 ساعت بعد نمونه گیري مجدد صورت
گرفته و آزمایش تکرار شود. در صورتیکه غلظت hCG در نمونه بیش از L/IU 1000 باشد جهت بدست آوردن غلظت صحیح می توان سرم را با استاندارد صفر
رقیق نموده و پس از بدست آوردن غلظت نمونه رقیق شده ، عدد حاصل را در ضریب رقت ضرب نمود .
نکته : هر چند طراحی این کیت به گونه اي است که از تاثیر عوامل مداخله گر تا حد امکان جلوگیري شود اما به ندرت امکان دارد بعضی عوامل موجود در
نمونه سرم ، از جمله آنتی بادي هاي هتروفیلیک ، برخی داروها ، اتوآنتی بادي ها و نظایر اینها بر نتیجه آزمایش اثر بگذارند . بنابر این بهتر است تفسیر نتیجه
آزمایش با در نظر گرفتن نتایج معاینات بالینی ، یافته هاي تشخیصی دیگر و شرح حال بیمار انجام گیرد .

شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD(، حداقل غلظت hCG قابل تشخیص در این کیت L/IU 1 می باشد .
2) دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري
آزمایشات مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف hCG انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :
جدول شماره1 (اینترا- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (L/IU (SD %CV
5/5 0/8 14/5 24 1
3/6 8/2 228 24 2
5 45 890 24 3
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (L/IU (SD %CV
7 1/12 15/9 10 1
4/5 10/5 231 10 2
6/3 56/8 906 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از hCG به 4 سرم با غلظتهاي مشخص hCG افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :

قدار hCG موجود در سرم نمونه
(IU/L)
مقدار افزوده شده hCG
(IU/L)
مقدار مورد انتظار
(IU/L)
مقدار بدست آمده
(IU/L)
ریکاوري
(%)
96 24 25 25 25 1
105 144 137/5 250 25 1
98 501 512/5 1000 25 1
93 73 78 25 131 2
106 202 190/5 250 131 2
98 555 565/5 1000 131 2
103 202 195 25 365 3
102 315 307/5 250 365 3
101 690 682/5 1000 365 3
98 425 432/5 25 840 4
104 565 545 250 840 4
98 900 920 1000 840 4

خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 4 نمونه سرم با غلظت مشخص از hCG تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج
آن آورده شده است :
مقدار hCG موجود در سرم نمونه
رقیق نشده(L/IU(
ریکاوري (%)
رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16
96 100 105 94 435 1
99 97 102 95 814 2
99 93 100 98 1370 3
98 96 98 101 1890 4
٥) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهایی با غلظتهاي مختلف hTSH , hFSH و hLH جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با hCG بررسی شد که نتایج آن در
جدول زیر آمده است :
جدول اختصاصیت (واکنش متقاطع) :
غلظت ظاهري hCG آنالیت غلظت
(IU/L)
hFSH (IU/L)
1000
500
200
100
<1
hTSH (mIU/L)
1000
500
200
100
< 1
hLH (IU/L)
1000
500
200
100
< 1
٦) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش hCG جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا L/IU 500/000 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References:
Bagshave K.D.(1984)Clinical applications of hCG.Adv. in Exper. Med .and Biol. 176:313-324.
Braunstein G.D., Rasor J., Adler D. et al.(1976) Serum human chorionic gonadotropin levels throughout normal
pregnancy. Am. J. Obst. Gynec. 126:678.
Saller B., Clara R., Spottl G. et al. (1990) Testicular cancer secretes intact human choriogonadotropin (hCG) and its
free B-subunit: Evidence that hCG (+hCG-B) assays are the most reliable in diagnosis and follow-up. Clin. Chem. 36/2:234-239.
Bogart M.H., Pandian M.R. and Jones O.W. (1987) Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in
pregnancies with fetal chromosome abnormalities. Prenatal Diagnosis 7:623-630.

روش انجام آزمایش Rapid hCG بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد hCG
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید. 5 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را
برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
آنزیم کنژوگه 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید. 5 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را
برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
5 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر
(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .