کیت الایزا HSV IgG

کیت سنجش آنتی باديIgG ضد 1،2HSV به روش الایزا
مقدمه :
هرپس ویروس ها شامل گروه بزرگی از ویروس هاي DNA دار و از شایع ترین عوامل عفونت هاي انسانی در تمام جهان هستند. عفونت ویروسی هرپس سیمپلکس توسط
دو نوع مختلف ویروس تیپ1و تیپ2 ایجاد می شود. ویروس تیپ 1(1 HSV (بیشتر نواحی غیر تناسلی و تیپ 2 (2 HSV (بیشتر نواحی تناسلی را گرفتار می کنند . به
عفونت ایجاد شده بوسیله ویروس تیپ 1 تبخال غیر تناسلی (sore cold (گفته می شود و ابتلاي به آن از سنین پایین شروع میشود. به طوري که 90 درصد افراد تا قبل
از 5 سالگی با ویروس تماس پیدا میکنند . در این بیماري، معمولاً لب ها ، لثه ها و ناحیه دهان، ندرتاً قرنیه، و گاهی ناحیه تناسلی بوسیله تاول هاي بسیار کوچک و دردناك
گرفتار می شوند. اگر چشم نیز دچار عفونت شود، علایمی چون درد و قرمزي چشم ، احساس این که در چشم چیزي وجود دارد، حساسیت به نور، و ریزش اشک بروز
مسري هستند. ویروس تیپ 2 اغلب تبخالهاي تناسلی ایجاد میکند و تماس با آن بیشتر در دوران بعد از بلوغ و شروع فعالیت جنسی است. علائم بیماري معمولاً 4 تا 7 می کنند. ویروس از طریق تماس فرد به فرد یا تماس با ترشحات بزاقی، چشمی، ادرار یا مدفوع انتقال می یابد. تاول ها و زخم هاي تب خال تا زمانی که بهبود نیافته باشند
روز بعد از تماس با فرد حامل ویروس یا ترشحات حاوي ویروس بروزمی نماید. البته ، در اغلب موارد ، ابتلا بدون علامت می باشد. عفونتهاي بدون علامت HSV می تواند
در دوران حاملگی و در افراد سالم رخ دهد .همچنین عفونتهاي هرپسی در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی و بیماران تحت درمان با داروهاي ایمونوساپرسیو معمول می
باشد. شایعترین علامت بیماري تبخال تناسلی ، در صورت ایجاد، پیدایش تاولهاي کوچک آبدار در ناحیۀ تناسلی است که بعداً پاره میشوند و زخمهاي دردناکی ایجاد
سفتی گردن 3 تا 12 روز بعد از ضایعات تناسلی ایجاد میشود. علاوه بر تماس جنسی ، تماس پوست با ترشحات تنفسی افراد آلوده میتواند باعث انتقال عفونتهاي تبخالی میکنند . در خانمها ممکن است ترشحات آبکی واژینال هم مشاهده شود. در برخی افراد به دنبال انتشار ویروس به دستگاه عصبی علائمی همچون تب، سردرد، استفراغ و
شود لذا شاغلین حرف خاصی از جمله دندانپزشکان، کارکنان بیمارستان ها و آزمایشگاهها در معرض خطر بیشتري براي اکتساب بیماريهاي تبخالی هستند. همچنین انتقال
از مادر به فرزند در حین زایمان یکی از راههاي مهم انتقال است. آنتی بادیهاي 1،2 HSV معمولا4-6ً هفته پس ازعفونت افزایش یافته و سپس در طی زمان کاهش می
یابند. جداسازي آنتی بادي اختصاصی تولید شده بر علیه آنتی ژنهاي اختصاصی این ویروس در تشخیص عفونت حاد یا مزمن، در غیاب علائم کلینیکی مهم می باشد .
اساس آزمایش :
در ا ین کیت آنتی ژنهاي 1،2 HSV به داخل چاهک ها متصل گردیده اند (coating(. در هنگام آزمایش، نمونه هاي رقیق شده داخل چاهکها ریخته می شوند. در صورت
شده، در صورت وجود آنتی بادي هاي ضد 1،2 HSV از نوع IgG ، آنتی هیومن IgG نیز به آنها متصل می گردد. پس از شستشو، محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می وجود آنتی بادي علیه انتی ژنهاي 1،2 HSV این آنتی بادیها به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می گردند. سپس با افزودن آنتی بادي ضد IgG که به آنزیم HRP متصل
شود که شدت رنگ آبی، متناسب با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است. افزودن محلول متوقف کننده، رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري
را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي 1،2 HSV) plate coated 1,2 HSV (.
2) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: دو ویال هر یک حاوي50 میلی لیتر محلول جهت رقیق کردن نمونه ها.
3) محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی بادي ضد IgG انسانی متصل شده به آنزیم پراکسیداز .
4) استانداردها (set Standards (: 5 ویال استاندارد شامل غلظت هاي صفر , ,10 50 , 100 و 200 ml/AU از آنتی بادي ضد 1،2 HSV از نوع IgG) استاندارد صفر و
10حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1/5 میلی لیتر می باشند) .
5) سرم کنترل (Serum Control (: یک ویال شامل 1/5 میلی لیتر سرم حاوي IgG علیه HSV با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه (آماده براي مصرف ) .
7) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (داراي محلول بافر فسـفات و %0/05 تـوئین . جهـت ته یـ ه محلـول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک یک نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .

مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس).
2 ) سمپلرهاي 10 و 100 میکرولیتري دقیق.
3 ) آب مقطر.
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2) این کیت صرفا جهت اندازه گیري IgG 1,2 HSV -Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
3) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg وآنتی بادیهاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل مـ ی باشـند ، جهـت احت یـ اط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید . پایداري پلیت پس از باز کردن کیسه آن 4 ماه میباشد .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار لازم از محلول شستشوي غلیظ را به نسبت 1 به 20 با آب مقطر رقیق کنید (بطور مثال می توان 50 میلی لیتر از
محلول شستشوي غلیظ را با آب مقطر به حجم یک لیتر رساند) . قابل ذکر است که پس از تهیه محلول شستشوي آماده مصرف می توان آنرا یک هفته در یخچال نگهداري
کرد و پس از یک هفته ، دیگر قابل استفاده نمی باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از سلولهاي خون استفاده نمود ، نمونه میتواند براي مدت دو روز در دماي 2-8 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري
بیش از مدت دو روز باید از دماي-20 درجه سانتی گراد استفاده گردد (در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) . از نمونه هاي مشکوك به آلودگی میکروبی
جهت انجام آزمایش استفاده نشود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را در وسط و ته چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد. بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب آنها را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 101 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 1 میلی لیتر محلول رقیق کننده نمونه) .

توجه : استانداردها و کنترل کیت آماده مصرف بوده و نیازي به رقیق سازي ندارند .
3) 100 میکرولیتر ازاستانداردها ، سرم کنترل و نمونه هاي رقیق شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید :
در10چاهک ردیف اول استانداردها و در 2 چاهک بعد سرم کنترل را به صورت دوپلیکیت و به ترتیب بریزید . سایر چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید .
4) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ، چاهکها را براي مدت 30 دقیقه در دماي اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه کنید.
5 ) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید . براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله و یا سرنگ استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش
گردد. در هر دفعه شستشو حدود300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو،
چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .
6) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف را به داخل چاهکها بریزید .
7) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ، چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید.
8) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 5) .
9) 100میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به چاهکها اضافه نمایید .
10) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
11) با اضافه کردن 100میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ، ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید. براي سنجش جذب نوري هر چاهک از
دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm450 استفاده نموده و جذب نوري چاهکها را قرائت نمایید . توصیه میشود از فیلتر nm630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
 میانگین جذب نوري کمتر از 0/1 براي استاندارد صفر . در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته و یا محلول کروموژن کیت
آلوده شده است . آزمایش را دوباره انجام داده ،در مراحل شستشو دقت کرده و محلول کروموژن را از نظر وجود رنگ آبی بررسی کنید .
 میانگین جذب نوري استاندارد 10باید بیشتر از استاندارد صفر باشد .
 میانگین جذب نوري بیشتر از 1/5براي استاندارد 200ضروري است . جذب نوري کمتر از 1/5 براي استاندارد 200 بیانگر خراب شدن استاندارد و یا کیت است . در این
حالت تاریخ انقضاء کیت و استاندارد را بررسی کنید .
محاسبه نتایج :
جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
الف) محاسبه کمی :
1) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها وغلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد به دست آورید . نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی استاندارد رسم شود .
2) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را به دست آورده و روي محور عمودي محل آن را پیدا کنید . نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمائید بطوریکه خط بر
محور عمودي کاملاً عمود باشد و سپس از محل تلاقی خط و منحنی ،خطی عمود بر محور افقی رسم کنید . نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان خواهد
داد .
دریک جمعیت نرمال ، مقدار off-cut معادل استاندارد 10ml/AU می باشد . مقادیر پایین تر از این مقدار منفی و بالاتر از این مقدار مثبت تلقی می شوند . افرادي که مقدار
آنتی بادي آنها بین -11 9 ml/AU می باشد مشکوك بوده و باید پس از مدتی با استفاده از سرم و یا پلاسماي تازه مجدداً آزمایش شوند .

نمونه جذب نوري استاندارد ها و نمودار حاصله :
Standard curve
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
0 50 100 150 200 Standard Concentration
OD
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
ب) محاسبه کیفی :
1) جهت محاسبه مقدار off-Cut ، میانگین جذب نوري استاندارد ml/AU 10 را بدست آورید :
Cut-off value = Mean OD of standard 10 AU/ml
2) براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی ، مقدار ایندکس را از تقسیم جذب نوري نمونه ها بر مقدار off-Cut بدست آورید :
Cut-off Index (COI) = OD of sample/Cut-off value
بر اساس این فرمول مقادیر بالاتر از 1/1 مثبت و پایین تر از 0/9 منفی قلمداد می شوند . نمونه هایی که مقدار ایندکس آنها 1/1 – 0/9 می باشد مشکوك بوده و باید پس
از مدتی با استفاده از سرم یا پلاسماي تازه مجدداًآزمایش شوند .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت :
250 عدد سرم مثبت تایید شده به روش کمی لومینسانس و الایزاي مرجع توسط این کیت آزمایش شدند که همگی مثبت بودند . با توجه به نتایج بدست آمده حساسیت این
کیت جهت اندازه گیري آنتی بادي IgG علیه 1،2 HSV 100 در صد بوده و با کیتها و روشهاي تاییدي معتبر قابل مقایسه می باشد .
2) اختصاصیت :
تعداد 120 نمونه سرم منفی به طور همزمان با این کیت و روش کمی لومینسانس آزمایش شدند که با کیت حاضر همگی منفی بودند . براساس نتایج بدست آمده اختصاصیت
کیت در حدود100 درصد می باشد .
3) دقت آزمایش :
جهت بررسی تکرار پذیري کیت ، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله سرم منفی ، مثبت و مثبت ضعیف
انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .
AU/ml ) استانداردها
(
جذب نوري
0 0/03
10 0/36
50 1/28
100 1/70
200 2/20

آزمون دقت درون سنجی (assay-Intra (:
نمونه منفی 20 3/5 0/3 8/6
نمونه مثبت 1 20 137 5/2 3/8
نمونه مثبت 2 20 14 0/9 6/4
تعداد دفعات تکرار تست میانگین غلظت (ml/AU (SD %CV – آزمون دقت میان سنجی (assay-Inter (:
نمونه منفی 10 4/0 0/37 9/2
نمونه مثبت 1 10 146 6/1 4/2
نمونه مثبت 2 10 15 1/0 6/7
*هر سري آزمایش، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
References:
1- ENGVALl.E.and PERLMANN.P.(1997) Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay for immunoglobulin.
J.immunochemistry (8) 871-874 . 2- Brooks Georf, Butel janet, S.Jawetz,melnick & Adelbery`s medical microbiology twenty second edition. Mc Grow-Hill 2001 . 3- Murray Patrick, R.Rosenthal, Ken. S.Kobayashi, George S. Medical Microbiology fourth Edition…mosby 2002 . 4- Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe DM, Howley PM, editors. Fields Virology.
Philadelphia: Lippincott Raven Press; 2001. p. 2399–2460 . 5- Munday, PE; Vuddamalay, J; Slomka, MJ; Brown, DW. Role of type specific herpes simplex virus serology in the diagnosis and
management of genital herpes. Sex Transm Infect. 1998 Jun;74(3):175–178 . شماتیک صورت به HSV1,2 IgG آزمایش انجام روش
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژنهاي 1،2 HSV
سرم کنترل – 100 میکرولیتر – استانداردها 100 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه رقیق شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
کنژوگه آماده مصرف 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید.
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر
(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید.