کیت الایزا HSV IgM

سنجش آنتی بادي IgM اختصاصی علیه ویروسهاي 1,2HSV به روش الایزا
مقدمه :
هرپس ویروس ها شامل گروه بزرگی از ویروس هاي DNA دار و از شایع ترین عوامل عفونت هاي انسانی در تمام جهان هستند. عفونت ویروسی هرپس سیمپلکس
توسط دو نوع مختلف ویروس تیپ 1 و تیپ 2 ایجاد می شود. ویروس تیپ1 (1HSV (بیشتر نواحی غیر تناسلی وتیپ 2 (2HSV (بیشتر نواحی تناسلی را گرفتار می
کنند. به عفونت ایجاد شده بوسیله ویروس تیپ 1 تبخال غیر تناسلی (sore cold (گفته می شود و ابتلاي به آن از سنین پایین شروع میشود. به طوري که 90 درصد
افراد تا قبل از 5 سالگی با ویروس تماس پیدا میکنند. در این بیماري ، معمولاً لب ها، لثه ها و ناحیه دهان، ندرتاً قرنیه، و گاهی ناحیه تناسلی بوسیله تاول هاي بسیار
کوچک و دردناك گرفتار می شوند. اگر چشم نیز دچار عفونت شود، علایمی چون درد و قرمزي چشم، احساس این که در چشم چیزي وجود دارد، حساسیت به نور، و
اشک ریزش بروز می کنند. ویروس از طریق تماس فرد به فرد یا تماس با ترشحات بزاقی، چشمی، ادرار یا مدفوع انتقال می یابد. تاول ها و زخم هاي تبخال تا زمانی که
بهبود نیافته باشند مسري هستند. ویروس نوع 2(2HSV (اغلب تبخالهاي تناسلی ایجاد میکند و تماس با آن بیشتر در دوران بعد از بلوغ و شروع فعالیت جنسی است .
علائم بیماري معمولاً 4 تا 7 روز بعد از تماس با فرد حامل ویروس یا ترشحات حاوي ویروس بروزمی نماید. البته، در اغلب موارد، ابتلا بدون علامت می باشد. عفونتهاي
بدون علامت HSV می توانند در خلال حاملگی و در افراد سالم رخ دهند. همچنین عفونتهاي هرپسی در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی و بیماران تحت درمان با
میشوند و زخمهاي دردناکی ایجاد میکنند. در خانمها ممکن است ترشحات آبکی واژینال هم مشاهده شود. در برخی افراد به دنبال انتشار ویروس به دستگاه عصبی داروهاي ایمونوساپرسیو معمول می باشند. شایعترین علامت بیماري تبخال تناسلی، در صورت ایجاد ، پیدایش تاولهاي کوچک آبدار در ناحیۀ تناسلی است که بعداً پاره
علائمی همچون تب ، سردرد، استفراغ و سفتی گردن 3 تا 12 روز بعد از ضایعات تناسلی ایجاد میشود. علاوه بر تماس جنسی، تماس پوست با ترشحات تنفسی افراد
آلوده میتواند باعث انتقال عفونتهاي تبخالی شود لذا شاغلین حرف خاصی از جمله دندانپزشکان ، کارکنان بیمارستان ها و آزمایشگاهها در معرض خطر بیشتري براي
اکتساب بیماريهاي تبخالی هستند. همچنین انتقال از مادر به فرزند در حین زایمان یکی از راههاي مهم انتقال است .آنتی بادي هاي IgM علیه 1HSV و2HSV طی
عفونت اولیه افزایش یافته و سپس در طی زمان کاهش می یابند و جاي خود را به آنتی بادي هاي IgG و IgA می دهند. جداسازي آنتی بادي IgM اختصاصی تولید شده
بر علیه آنتی ژنهاي این ویروس در تشخیص عفونت حاد مفید می باشد .
اساس آزمایش :
ریخته می شوند. در صورت وجود آنتی بادي علیه انتی ژنهاي 1HSV و2HSV این آنتی بادي ها به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می گردند. سپس با افزودن آنتی در ا ین کیت آنتی ژنهاي ویروسهاي 1HSV و 2HSV به داخل چاهک ها متصل گردیده اند (coating (. در هنگام آزمایش، نمونه هاي رقیق شده به داخل چاهکها
بادي ضد IgM که به آنزیم HRP متصل شده، در صورت وجودآنتی بادي هاي ضد 1HSV و 2HSV از نوع IgM ، آنتی هیومن IgM نیز به آنها متصل می گردد. پس
از شستشو، محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می شود که شدت رنگ آبی ، متناسب با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است. افزودن محلول متوقف کننده، رنگ
آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي 1HSV و2HSV) plate coated 1,2HSV (.
2) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول جهت رقیق کردن نمونه ها .
3) محلول اسی بافر (Buffer Assay (: یک ویال حاوي 7/5 میلی لیتر محلول IgG human Anti جهت مهار کردن روماتویید فاکتور و غلظتهاي بالاي IgG در نمونه
ها .
4) محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی بادي ضد IgM انسانی متصل شده به آنزیم پراکسیداز .
5) سرم کنترل مثبت (Control Positive (: یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول بافري، داراي پروتئین به عنوان پایدار کننده و 0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم
انسانی غیر فعال شده، حاوي آنتی بادي IgM علیه 1,2HSV .
6) سرم کنترل منفی (Control Negative ( : یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول داراي بافر فسفات و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی منفی از نظر
آنتی باديIgM علیه 1,2HSV .
7) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه ( آماده براي مصرف ) .
8) محلول شستشو (Buffer Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (داراي محلول بافر فسفات و %0/05 تـوئین . جهـت تهیـه محلـول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
9) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلرید ریک 1 نرمال .

0) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس).
2) سمپلر هاي دقیق .
3 ) آب مقطر
4) بن ماري یا انکوباتور C37°
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2) این کیت صرفا جهت اندازه گیري IgM 1,2HSV Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
3) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg وآنتی بادیهاي HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت احتیاط بهتر
است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را دریخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید. پایداري پلیت پس از باز کردن کیسه آن 4 ماه میباشد .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف، مقدار لازم از محلول شستشوي غلیظ را به نسبت 1 به 20 با آب مقطر رقیق کنید (بطور مثال می توان 50 میلی لیتر از
محلول شستشوي غلیظ را با آب مقطر به حجم یک لیتر رساند) . قابل ذکر است که پس از تهیه محلول شستشوي آماده مصرف می توان آنرا یک هفته در یخچال
نگهداري کرد و پس از یک هفته، دیگر قابل استفاده نمی باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از سلولهاي خون استفاده نمود، نمونه میتواند براي مدت دو روز در دماي 8 – 2 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي
نگهداري بیش از مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد (در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود). از نمونه هاي مشکوك به
آلودگی میکروبی جهت انجام آزمایش استفاده نشود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را در وسط و ته چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد. بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب آنها را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود.

مراحل انجام آزمایش :
آماده سازي اولیه نمونه ها :
الف : نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 51 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 500 میکرولیتر محلول رقیق کننده نمونه) .
توجه : کنترلهاي کیت آماده مصرف بوده و نیازي به رقیق سازي ندارند .
ب : 75 میکرولیتر از نمونه هاي رقیق شده را داخل لوله دیگري ریخته و 75 میکرولیتر از محلول اسی بافر به آنها اضافه کنید. سپس به مدت 10 دقیقه در دماي اتاق
نگهداري نمایید .
روش انجام تست :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و بقیه چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید.
2) 100 میکرولیتر از کنترل ها و 100 میکرولیترازنمونه هاي آماده شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید :
دو چاهک اول را براي بلانک و کنترل مثبت در نظر بگیرید.کنترل منفی را به صورت دوپلیکیت ریخته و سایر چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید. پس از پوشاندن
چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت، چاهکها را براي مدت30 دقیقه در دماي37 درجه سانتی گراد قرار دهید .
3) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان
از سمپلر 8 کاناله و یا سرنگ استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود
زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد. در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه
کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو، چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج
شوند .
4)100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف را به چاهکها به استثناي چاهک بلانک بریزید . پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ، چاهکها
را به مدت 30 دقیقه در دماي37 درجه سانتی گراد قرار دهید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. (همانند بند 3)
6) 100میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به همه چاهکها اضافه نمایید . چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی قرار دهید .
7) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک، واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک از
دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نموده و جذب نوري چاهکها را قرائت نمایید. توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد.
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
– جذب نوري کمتر از0/1 براي بلانک، در صورت بیشتر بودن جذب نوري بلانک احتمالاً محلول رنگزا آلوده شده است .
– جذب نوري کمتر از 0/15 براي کنترل منفی ، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري، احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است، آزمایش را دوباره انجام داده و
در مراحل شستشو دقت کنید .
– جذب نوري بیشتر از 0/6 براي کنترل مثبت .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
1) جذب نوري کنترلها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزا ریدر در طول موج nm450 و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm630 بخوانید.
2) جذب نوري بلانک را از کنترلها و نمونه ها کم کنید.
3) مقدار Off Cut را طبق فرمول زیر بدست آورید.
+0/

4) براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی، مقدار ایندکس را از تقسیم جذب نوري نمونه بر مقدار off-Cut بدست آورید :
Cut-off Index(COI) = OD of sample/Cut-off value
بر اساس این فرمول مقادیر بالاتر از 1/1 مثبت و پایین تر از 0/9 منفی قلمداد می شوند. نمونه هایی که مقدار ایندکس آنها بین 0/9-1/1 می باشد مشکوك بوده و باید پس
از مدتی با استفاده از سرم یا پلاسماي تازه مجددا” آزمایش شوند .
بررسی نتایج :
 جواب منفی نشان دهنده عدم وجود آنتی بادي IgMعلیه 1,2HSV می باشد. جوابهاي مثبت باید مجدداً تکرار شوند. نمونه هاي مثبتی که در تکرار مجدد منفی میشوند،
باید منفی گزارش گردند. مثبت شدن آزمایش در مرتبه اول می تواند به علت خطاي کاري درمراحل شستشو و یا نمونه برداري باشد .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت : 60عدد سرم مثبت تائید شده با روش کمی لومینسانس والایزاي مرجع با این کیت آزمایش شدند که 59 موردمثبت بودند. با توجه به نتایج بدست آمده
حساسیت کیت جهت اندازه گیري آنتی باديIgM علیه 1,2HSV 98، درصد بوده و با کیتها و روشهاي تاییدي معتبر قابل مقایسه می باشد .
2) اختصاصیت : 500 عدد سرم منفی به طور همزمان با این کیت و روش کمی لومینسانس آزمایش شدند که با روش این کیت تمامی 500 نمونه منفی بودند . بر اساس
نتایج بدست آمده اختصاصیت این کیت 100 درصد می باشد .
3) دقت آزمایش : جهت بررسی تکرارپذیري کیت، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله کنترل منفی
و مثبت و یک نمونه سرمی مثبت ضعیف انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD %CV – آزمون دقت درون سنجی (assay -Intra (:
کنترل مثبت 20 1/0 0/13 13
کنترل منفی 20 0/05 0/003 6
نمونه مثبت ضعیف 20 0/23 0/013 5/6
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD %CV – آزمون دقت میان سنجی (assay -Inter (:
کنترل مثبت 10 1/1 0/14 12/7
کنترل منفی 10 0/05 0/004 8
نمونه مثبت ضعیف 10 0/24 0/02 8/3
*هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
References: Mahy B.W.J and Meulen V.T. (2005). Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections: Virology. Volume 2. Tenth
edition. London. Hodder Arnold . Lennette E.H. and Smith T.F. (1999). Laboratory diagnosis of viral infections. Third edition. New York. Marcel Dekker.
Connie R.M. and Manuselis G. (2000). Text book of diagnostic microbiology. Second edition. Philadelphia. W.B. Saunders. Major M.E., Rehermann B. and Feinstone S.M. (2001). Fields Virology. Fourth edition.Philadelphia. Lippincott Williams and
Wilkins.

روش انجام تست IgM1,2-HSV به صورت شماتیک
* نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 51 رقیق کنید. سپس 75 میکرولیتر از نمونه هاي رقیق شده را با 75 میکرولیتر از محلول اسی بافر مخلوط
کرده و به مدت 10 دقیقه در دماي اتاق قرار دهید .
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژن هاي اختصاصی 1,2 HSV
کنترل ها – 100 میکرولیتر – محلولها بلانک کنترل ها نمونه
نمونه آماده شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد قرار دهید. برچسب پلیت را برداشته
و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو ، 5 بار چاهکها را بشویید .
آنزیم کنژوگه – 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد قرار دهید. برچسب پلیت را برداشته
و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو ، 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی قرار دهید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در مقابل بلانک و در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت
کنید.