کیت الایزا Toxoplasma IgG

کیت سنجش آنتی بادي IgG ضد توکسوپلاسما گوندي به روش الایزا
مقدمه :
توکسوپلاسما انگلی با انتشار جهانی است که اولین بار در یک جونده آفریقایی به نام کتنوداکتیلوس گوندي توصیف شد و نام گونه خود را از این جونده گرفته است. میزبان
نهایی این انگل گربه خانگی و انواع خاصی از دیگر اعضاي گربه سانان هستند. اکثر عفونتهاي انسانی با توکسوپلاسما در بزرگسالان خوش خیم میباشند و به خودي خود
بهبود می یابند اما کیست هاي نسجی ایجاد شده تا سالها در بدن شخص باقی می مانند . شدیدترین نوع توکسوپلاسموزیس نوع مادرزادي آن است . در صورتیکه مادر
قبلا”به عفونت مبتلا نشده باشد و در زمان حاملگی عفونت را کسب کند انگل در فاز حاد می تواند از جفت عبور کرده و باعث عوارض گوناگونی شود. کسب عفونت در سه
ماهه اول جنینی ممکن است باعث سقط جنین شود. اما در سه ماهه دوم منجر به تولد نوزاد با نقایصی نظیر کلسیفیکاسیون مغز و به میزان کمتر هیدروسفالی و میکروسفالی
می شود . اختلالات حرکتی با منشاء عصبی نیز شایع است . عوارض غیر قابل برگشت بوده و نوزادانی که زنده می مانند با علائم عقب ماندگی دست به گریبانند. کسب
عفونت در سه ماهه آخر معمولا”منجر به عوارض چشمی بعدي نظیر کوریورتینیت می شود. از این رو تشخیص عفونت در دوران حاملگی حایز اهمیت می باشد. امروزه از
روشهاي ایمونوفلورسانس و الایزا جهت تشخیص آنتی بادي از نوع IgG و IgM ضد توکسوپلاسما استفاده می شود. از آنجا که آنتی بادي IgG ضد توکسوپلاسما به طور
معمول نیز در جمعیتهاي مختلف دیده می شود، براي تشخیص دقیق و درست عفونت با این انگل افزایش عیار آنتی بادي IgG در دو نمونه سرمی که حداقل به فاصله 10
روز گرفته شده باشد و یا شناسایی IgM اختصاصی ضد توکسوپلاسما در یک نمونه منفرد لازم است. کیت حاضر قابلیت سنجش آنتی بادي IgG ضد توکسوپلاسما را با
حساسیت و اختصاصیت بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
در این کیت آنتی ژنهاي توکسوپلاسما به داخل چاهک ها متصل گردیده اند (coating(. در هنگام آزمایش، نمونه هاي رقیق شده ، داخل چاهکها ریخته می شوند. در
صورت وجود آنتی بادي علیه آنتی ژنهاي توکسوپلاسما این آنتی بادیها به آنتی ژنهاي کف چاهک متصل می گردند . سپس با افزودن آنتی بادي ضد IgG که به آنزیم
HRP متصل شده، در صورت وجودآنتی بادي هاي ضد توکسوپلاسما از نوع IgG، آنتی هیومن IgG نیز به آنها متصل می گردد. پس از شستشو، محلول رنگزا داخل
چاهکها ریخته می شود که شدت رنگ آبی، متناسب با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است. افزودن محلول متوقف کننده، رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که
بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد.
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی ژنهاي توکسوپلاسما (plate coated Toxoplasma (.
2) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: دو ویال هر یک حاوي50 میلی لیتر محلول جهت رقیق کردن نمونه ها .
3) محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر آنتی بادي ضد IgG انسانی متصل شده به آنزیم پراکسیداز .
4) استانداردها (set Standards (: 5 ویال استاندارد شامل غلظت هاي صفر , 10 , 50 , 100 , 200 ml/IU از آنتی بادي ضد توکسوپلاسما از نوع IgG ، کالیبره شده در
مقابل استانداردهاي مرجع WHO .) استانداردهاي صفر و 10 حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1/5 میلی لیتر می باشند) .
5) سرم کنترل (Serum Control (: ویال حاوي 1/5 میلی لیتر سرم که داراي IgG علیه توکسوپلاسما با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال میباشد .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه (آماده براي مصرف) .
7) محلول شستشو (Buffer Wash ( : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (داراي محلول بافر فسفات و %0/05 تـوئین . جهـت تهیـه محلـول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند:
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي 10 و 100 میکرولیتري دقیق .
3) آب مقطر .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2) این کیت صرفا جهت اندازه گیري IgG Toxoplasma-Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
3) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg وآنتی بادیهاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهـت احتیـاط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید . پایداري پلیت پس از باز کردن کیسه آن 4 ماه میباشد .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از سلولهاي خون استفاده نمود، نمونه میتواند براي مدت دو روز در دماي 8 – 2 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي
نگهداري بیش از مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد (در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) . از نمونه هاي مشکوك به آلودگی
میکروبی جهت انجام آزمایش استفاده نشود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهکها حد اکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را در وسط و ته چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب ،زمان انکوباسیون مناسب می باشد . بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب آنها را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 101 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 1 میلی لیتر محلول رقیق کننده نمونه) .
توجه : استانداردها و سرم کنترل کیت آماده مصرف بوده و نیازي به رقیق سازي ندارند .
3) 100 میکرولیتر از استانداردها ، سرم کنترل و نمونه هاي رقیق شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید : در 10چاهک ردیف اول استانداردها و در 2 چاهک بعد سـرم
کنترل را به صورت دوپلیکیت و به ترتیب بریزید . بقیه چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید .
4) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت ، چاهکها را براي مدت 30 دقیقه در دماي اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه کنید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید . براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله و یا سرنگ استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش
گردد . در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات
شستشو ، چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .
6) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه آماده مصرف را به داخل چاهکها بریزید .

7) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت، چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
8) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 5) .
9) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به چاهکها اضافه نمایید .
10) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
11) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ، ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر
چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نموده و جذب نوري چاهکها را قرائت نمایید. توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
1) میانگین جذب نوري کمتر از 0/1 براي استاندارد صفر. در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته و یا محلول کروموژن کیت
آلوده شده است . آزمایش را دوباره انجام داده، در مراحل شستشو دقت کرده و محلول کروموژن را از نظر وجود رنگ آبی بررسی کنید .
2) میانگین جذب نوري استاندارد 10 باید بیشتر از استاندارد صفر باشد .
3) میانگین جذب نوري بیشتر از 1/5براي استاندارد 200 ضروري است. جذب نوري کمتر از 1/5 براي استاندارد 200 بیانگر خراب شدن استاندارد و یا کیت است . در این
حالت تاریخ انقضاء کیت و استاندارد را بررسی کنید .
محاسبه نتایج :
جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
الف) محاسبه کمی :
1) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها وغلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد به دست آورید . نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی استاندارد رسم شود .
2) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را به دست آورده و روي محور عمودي محل آن را پیدا کنید . نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه خط بر
محور عمودي کاملاً عمود باشد و سپس از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی رسم کنید . نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد . در یک جمعیت نرمال ، مقدار off-cut معادل استاندارد 10ml/IU می باشد . مقادیر پایین تر از این مقدار منفی و بالاتر از این مقدار مثبت تلقی می شوند .
افرادي که مقدار آنتی بادي آنها بین -11 9 ml/IU می باشد مشکوك بوده و باید پس از مدتی با استفاده از سرم و یا پلاسماي تازه مجددا” آزمایش شوند .
نمونه جذب نوري استاندارد ها و نمودار حاصله :
Standard curve
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 50 100 150 200 Standard Concentration
OD
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید.
جذب نوري استانداردها ml/IU
0 0/04
10 0/36
50 1/27
100 1/85
200 2/60

ب) محاسبه کیفی :
1) جهت محاسبه مقدار off-Cut ، میانگین جذب نوري استاندارد ml/IU 10 را بدست آورید :
Cut-off value = Mean OD of standard 10 IU/ml
2) براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی ، مقدار ایندکس را از تقسیم جذب نوري نمونه ها بر مقدار off-Cut بدست آورید :
Cut-off Index (COI) = OD of sample/Cut-off value
بر اساس این فرمول مقادیر بالاتر از 1/1 مثبت و پایین تر از 0/9 منفی قلمداد می شوند. نمونه هایی که مقدار ایندکس آنها -1/1 0/9 می باشد مشکوك بوده و باید پس از
مدتی با استفاده از سرم یا پلاسماي تازه مجددا˝ آزمایش شوند .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت : 150 عدد سرم مثبت تائید شده به روش کمی لومینسانس و الایزاي مرجع توسط این کیت آزمایش شدند که همگی مثبت بودند . با توجه به نتایج
بدست آمده حساسیت این کیت جهت اندازه گیري آنتی بادي IgG علیه توکسوپلاسما 100 در صد بوده و با کیتها و روشهاي تاییدي معتبر قابل مقایسه می باشد .
2) اختصاصیت : تعداد 120 نمونه سرم منفی به طور همزمان با این کیت و روش کمی لومینسانس آزمایش شدند که با کیت حاضر 119 سرم منفی و 1 سرم مثبت
بودند که این نمونه مجددا با کیت تکرار شد. در تکرار مجدد ، سرم مذکور منفی گزارش گردید. بر اساس نتایج بدست آمده اختصاصیت کیت در حدود 100 درصد می باشد .
3) دقت آزمایش : جهت بررسی تکرار پذیري کیت، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله سرم
منفی، مثبت و مثبت ضعیف انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .
آزمون دقت درون سنجی(assay-Intra (:
تعداد دفعات تکرار تست میانگین غلظت (ml/IU (SD %CV
نمونه منفی 10 8 0/52 6/5
نمونه مثبت 1 10 150 11/2 7/5
نمونه مثبت 2 10 32 2/5 7/8
آزمون دقت میان سنجی(assay-Inter(:
تعداد دفعات تکرار تست میانگین غلظت (ml/IU (SD %CV
نمونه منفی 10 8/7 0/71 8/2
نمونه مثبت 1 10 142/6 15/8 11/1
نمونه مثبت 2 10 33/8 3/16 9/3
*هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .

References:
VOLK. W.A. (1982). Essential of Medical Microbiology. Second ed., pp 729, G.B. Lippincott Company, Philadelphia,New
York, S. Jose, Toronto
REMINGTON. J.S. and KLEIN. J.O. (1966). Infectious diseases of the fetus and newborn infant. Sanders, Philadelphia,
London, Toronto.
ENGVALL. E. and PERLMANN. P (1971). Enzyme linked immune sorbent assay (ELISA). Quantination of specific
antibodies by enzyme-labelled anti- immunoglobulin in antigen- coated tubes. J. Immunol. 109, 129-135
ENGVALL. E. and PERLMANN. P (1971). Enzyme linked immune sorbent assay (ELISA). Quantitative assay for
immunoglobulin. J. Immunochemistry, 8, 871-874

روش انجام آزمایش IgG Toxoplasma به صورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی ژنهاي توکسوپلاسما
سرم کنترل – 100 میکرولیتر – استانداردها 100 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه رقیق شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید. 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
کنژوگه آماده مصرف 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید 30. دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و
محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .