کیت الایزا Toxoplasma Igm

کیت سنجش آنتی بادي IgM ضد توکسوپلاسما گوندي به روش الایزا
مقدمه :
توکسوپلاسما انگلی با انتشار جهانی است که اولین بار در یک جونده آفریقایی به نام کتنوداکتیلوس گوندي توصیف شد و نام گونه خود را از این جونده گرفته است. میزبان
نهایی این انگل گربه خانگی و انواع خاصی از دیگر اعضاي گربه سانان هستند. اکثر عفونتهاي انسانی با توکسوپلاسما در بزرگسالان خوش خیم میباشند و به خودي خود بهبود
می یابند اما کیست هاي نسجی ایجاد شده تا سالها در بدن شخص باقی می مانند . شدیدترین نوع توکسوپلاسموزیس ، نوع مادرزادي آن است. در صورتیکه مادر قبلا”به
عفونت مبتلا نشده باشد و در زمان حاملگی عفونت را کسب کند انگل در فاز حاد می تواند از جفت عبور کرده و عوارض گوناگونی را باعث گردد. کسب عفونت در سه ماهه اول
جنینی ممکن است باعث سقط جنین شود . اما در سه ماهه دوم منجر به تولد نوزاد با نقایصی نظیر کلسیفیکاسیون مغز و به میزان کمتر هیدروسفالی و میکروسفالی می شود .
اختلالات حرکتی با منشاء عصبی نیز شایع است . عوارض غیر قابل برگشت بوده و نوزادانی که زنده می مانند با علائم عقب ماندگی دست به گریبانند .کسب عفونت در سه
ماهه آخر معمولا”منجر به عوارض چشمی بعدي نظیر کوریورتینیت می شود. از این رو تشخیص عفونت در دوران حاملگی حایز اهمیت می باشد. امروزه از روشهاي
ایمونوفلورسانس و الایزا جهت تشخیص آنتی بادي از نوع IgG و IgM ضد توکسوپلاسما استفاده می شود. در نوزادان بدلیل اینکه IgG از جفت عبور می کند ، می تواند
چندین ماه در گردش خون نوزاد باقی بماند، ولی چون آنتی بادیهاي IgM نمی توانند از جفت عبور کنند یافتن آن به هنگام تولد یا چند ماهگی امکان توکسوپلاسموزیس
مادرزادي را مطرح می کند. براي تشخیص دقیق و درست عفونت با توکسوپلاسما افزایش عیار آنتی بادي IgG در دو نمونه سرمی که حداقل به فاصله 10روز گرفته شده باشد
و یا شناسایی IgM اختصاصی ضد توکسوپلاسما در یک نمونه منفرد لازم است . کیت حاضر قابلیت سنجش آنتی بادي IgM ضد توکسوپلاسما را با حساسیت و اختصاصیت
بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
این کیت به روش capture Antibody طراحی شده است . چاهک هاي پلیت با antibody IgM human -Anti پوشانده شده اند. در هنگام آزمایش ، نمونه هاي رقیق
شده داخل چاهکها ریخته می شوند. تمامی IgM هاي موجود در نمونه سرم (از جمله IgM هاي ضد توکسوپلاسما) به آنتی بادیهاي کف چاهک متصل می شوند. پس از
شستشوي اولیه ، آنتی بادیهاي باند نشده جدا شده و در مرحله بعد کنژوگه کیت که شامل آنتی ژن توکسوپلاسما کنژوگه شده با HRP می باشد اضافه می گردد که آنتی ژن
فوق به IgM اختصاصی توکسوپلاسما متصل شده و ایجاد کمپلکس می نماید . پس از شستشو ، محلول رنگزا داخل چاهکها ریخته می شود که شدت رنگ آبی ، متناسب با
کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است. افزودن محلول متوقف کننده ، رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با IgM human -Anti .
2) محلول آنزیم کنژوگه غلیظ x20)x20 .conj Enzyme (: یک ویال حاوي 750 میکرولیتر از آنتی ژن توکسوپلاسما نشاندار شده با پراکسیداز در محلول بافري حاوي
3) محلول رقیق کننده کنژوگه (Diluent .Conj (: یک ویال حاوي 15 میلی لیتر محلول بافري حاوي پروتئین و نگهدارنده . پروتئین و نگهدارنده .
4) محلول رقیق کننده نمونه (Diluent Sample (: دو ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول ، جهت رقیق کردن نمونه ها .
5) سرم کنترل مثبت (Control Positive (: یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول بافري ، داراي پروتئین به عنوان پایدار کننده و 0/05 % کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم
6) سرم کنترل Off-Cut : یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول بافري داراي پروتئین به عنوان پایدار کننده و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی غیر فعال شده ، انسانی غیر فعال شده ، حاوي آنتی باديIgM علیه توکسوپلاسما .
حاوي آنتی باديIgM علیه توکسوپلاسما .
7) سرم کنترل منفی (Control Negative (: یک ویال حاوي 2 میلی لیتر محلول داراي بافر فسفات و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ و سرم انسانی منفی از نظر آنتی
8) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه (آماده براي مصرف) . بادي IgM علیه توکسوپلاسما .
9) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. داراي محلول بافر فسفات و %0/05 توئین . جهت تهیه محلول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
10) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
11) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان فیلتر 630 نانومتر به عنوان رفرانس) .
2) سمپلر هاي 10 و 100 میکرولیتري دقیق

3) بن ماري یا انکوباتور C37° .
4) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2) این کیت صرفا جهت اندازه گیري IgM Toxoplasma -Anti در سرم و پلاسماي انسانی طراحی و ساخته شده است .
3) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
4) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg وآنتی بادیهاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ، جهت احتیاط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید . پایداري پلیت بعد از باز کردن کیسه آن 4 ماه میباشد .
3) پایداري محتویات کیت (قبل از باز شدن درب کیت) تا پایان مدت انقضاء یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه میتواند براي مدت دو روز در دماي 8 – 2 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري بیش
از مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده کرد (در ضمن باید از thaw-Freeze کردن نمونه پرهیز شود). از نمونه هاي مشکوك به آلودگی میکروبی جهت
انجام آزمایش استفاده نشود .
آماده سازي محلول کنژوگه :
محلول کنژوگه آماده مصرف : براي تهیه مقدار کنژوگه مورد نیاز ، کنژوگه غلیظ را توسط محلول رقیق کننده کنژوگه به نسبت 1 به 20 رقیق کنید . بطور مثال براي
تهیه 1میلی لیتر محلول کنژوگه آماده مصرف ، 50 میکرولیتر از آنزیم کنژوگه غلیظ را با 950 میکرولیتر محلول رقیق کننده کنژوگه به خوبی مخلوط نمایید .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند .
3) باید از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را در وسط و ته چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب ، زمان انکوباسیون مناسب می باشد. بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را آماده
نموده و درب آنها را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) نمونه ها را با کمک محلول رقیق کننده نمونه به نسبت 1 به 101 رقیق کنید (10 میکرولیتر نمونه با 1 میلی لیتر محلول رقیق کننده نمونه) . توجه : کنترلهاي کیت
آماده مصرف بوده و نیازي به رقیق سازي ندارند .
3) 100 میکرولیتر از کنترل ها و 100 میکرولیتر از نمونه هاي رقیق شده را طبق دستور زیر در چاهک ها بریزید :
سه چاهک اول را براي بلانک ، کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر بگیرید . سرم کنترل off Cut را بصورت دوپلیکیت در دو چاهک بعدي ریخته و سایر چاهک ها را
براي نمونه ها استفاده کنید .
4) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت، چاهکها را براي مدت 30 دقیقه در انکوباتور و یا بن ماري 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید .

5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید. براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش
گردد. در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات
شستشو، چاهکها را در حالت وارونه با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .
6) 100 میکرولیتر از آنزیم کنژوگه آماده مصرف را داخل همه چاهکها به استثناي چاهک بلانک بریزید .
7) پس از پوشاندن چاهکها توسط برچسب مخصوص پلیت، چاهکها را به مدت 30 دقیقه در انکوباتور و یا بن ماري 37 درجه سانتی گراد انکوبه نمایید .
8) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 5) .
9) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به همه چاهکها ازجمله چاهک بلانک اضافه نمایید .
10) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
11) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نموده و جذب نوري چاهکها را قرائت نمایید . توصیه میشود از فیلتر nm630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد .
ارزشیابی آزمایش :
این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
1) جذب نوري کمتر از 0/1 براي بلانک ، در صورت بیشتر بودن جذب نوري بلانک احتمالاً محلول رنگزا آلوده شده است .
2) جذب نوري کمتر از 0/15 براي کنترل منفی ، در صورت بیشتر بودن این جذب نوري احتمالاً شستشو به طور صحیح صورت نگرفته است ، آزمایش را دوباره انجام داده و
در مراحل شستشو دقت کنید .
3) میانگین جذب نوري بیشتر از 0/15 براي سرم کنترل off-Cut .
4) جذب نوري بیشتر از 0/6 براي کنترل مثبت ، در صورت کمتر بودن به تاریخ انقضاي کیت توجه نمایید .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
1) جذب نوري کنترلها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm450 و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm630 بخوانید .
2) جذب نوري بلانک را از کنترلها و نمونه ها کم کنید .
3) جهت محاسبه مقدار off-Cut ، میانگین جذب نوري سرم کنترل off-Cut را بدست آورید :
Cut-off value = Mean OD of Cut-off control
براي تعیین جوابهاي مثبت و منفی ، مقدار ایندکس را از تقسیم جذب نوري نمونه بر مقدار off-Cut بدست آورید :
Cut-off Index (COI) = OD of sample/Cut-off value
بر اساس این فرمول مقادیر بالاتر از 1/1 مثبت و پایین تر از 0/9 منفی قلمداد می شوند . نمونه هایی که مقدار ایندکس آنها بین -1/1 0/9 می باشد مشکوك بوده و باید پس
از مدتی با استفاده از سرم یا پلاسماي تازه مجددا” آزمایش شوند .
بررسی نتایج :
1) جواب منفی نشان دهنده عدم وجود آنتی بادي IgM علیه توکسوپلاسما می باشد .
2) جوابهاي مثبت باید مجدداً تکرار شوند . نمونه هاي مثبتی که در تکرار مجدد منفی میشوند، باید منفی گزارش گردند. مثبت شدن آزمایش در مرتبه اول می تواند به علت
خطاي کاري درمراحل شستشو و یا نمونه برداري باشد .
شاخصهاي اجرایی :
1) حساسیت : 30 عدد سرم مثبت تایید شده با روش کمی لومینسانس و الایزاي مرجع با این کیت آزمایش شدند که همگی مثبت بودند . با توجه به نتایج بدست آمده
حساسیت کیت جهت اندازه گیري آنتی باديIgM علیه توکسوپلاسما ، 100 درصد بوده و با کیتها و روشهاي تاییدي معتبر قابل مقایسه می باشد .
2) اختصاصیت : 150عدد سرم منفی به طور همزمان با این کیت و روش کمی لومینسانس آزمایش شدند که با روش این کیت 148 نمونه منفی و 2 نمونه مثبت بودند و
این 2 نمونه مجددا با کیت تکرار شدند. در تکرار مجدد ، 1 سرم منفی ویک سرم مثبت گزارش شدند . بر اساس نتایج بدست آمده اختصاصیت کیت در حدود 99 درصد می باشد. جهت بررسی تداخلات 14 نمونه (9 نمونه مثبت ANA و 5 نمونه مثبت RF (که با دوکیت دیگر به روش الیزا منفی بودند با کیت پیشتاز طب مورد بررسی قرار
گرفت که همگی منفی بودند .
3) دقت آزمایش : جهت بررسی تکرارپذیري کیت ، آزمون هاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله کنترل منفی
و مثبت و یک نمونه سرمی مثبت ضعیف انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD %CV – آزمون دقت درون سنجی (assay -Intra (:
کنترل مثبت 10 1/2 0/08 6/6
کنترل منفی 10 0/028 0/003 10/7
نمونه مثبت 10 0/275 0/014 5/1
تعداد دفعات تکرار تست میانگین جذب نوري SD %CV – آزمون دقت میان سنجی (assay -Inter (:
کنترل مثبت 10 1/15 0/1 8/7
کنترل منفی 10 0/025 0/003 12
نمونه مثبت 10 0/267 0/018 6/7
*هر سري آزمایش ، به صورت دوپلیکیت انجام شده است .
References :
VOLK. W.A. (1982). Essential of Medical Microbiology. Second ed., pp 729, G.B. Lippincott Company, Philadelphia,New York, S. Jose,
Toronto
REMINGTON. J.S. and KLEIN. J.O. (1966). Infectious diseases of the fetus and newborn infant. Sanders, Philadelphia, London, Toronto.
ENGVALL. E. and PERLMANN. P. (1971). Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Quantination of specific antibodies by
enzyme-labelled anti- immunoglobulin in antigen- coated tubes. J. Immunol. 109, 129-135
ENGVALL. E. and PERLMANN. P. (1971). Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay for immunoglobulin. J.
Immunochemistry, 8, 871-874
روش انجام آزمایش IgM Toxoplasma به صورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با IgM human -Anti
کنترل ها – 100 میکرولیتر – محلول ها بلانک کنترل ها نمونه
نمونه رقیق شده – – 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید . برچسب
پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول آنزیم کنژوگه – 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید . برچسب
پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .