کیت سنجش هورمون تیروکسین (4T (به روش الایزا

کیت سنجش هورمون تیروکسین (4T (به روش الایزا
مقدمه :
هورمون تیروکسین (4T (در غده تیروئید از ید و تیروزین ساخته می شود. فقط 0/02 تا 0/03 درصد از این هورمون در خون بصورت آزاد وجود دارد و بقیه این هورمون
بصورت متصل با پروتئینها ست که اصلی ترین این پروتئینها ، تیروکسین بایندینگ گلوبولین (TBG (می باشد ، مقدار کل تیروکسین در خون (4T Total (به عنوان یک
فاکتور مهم در بررسی وضعیت تیروئید مطرح می باشد. بطور معمول در سرم افراد مبتلا به هیپرتیروئیدیسم مقدار 4T افزایش یافته و در افراد دچار هیپوتیروئیدیسم مقدار
آن کاهش می یابد ولی در هر حال در مواردي که مقدار پروتئینهاي متصل شونده به تیروکسین به دلایل فیزیولوژیک، ژنتیک و یا فارماکولوژیک به صورت نرمال
نمی باشد ممکن است که اندازه گیري مقدار کل 4T به تنهایی نتواند فاکتور صحیحی در سنجش عملکرد تیروئید باشد. کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون
هورمون تیروکسین را با اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
کیت 4T حاضر به روش رقابتی وبه کمک آنتی بادي مونوکلونال طراحی گردیده است. در این روش چاهکها توسط آنتی بادي منوکلونال که بر علیه مولکول 4T می باشد
پوشش داده می شوند (Coating (. استانداردها و نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور شده و سپس محلول اسی بافر
(buffer Assay (و در پی آن 4T کنژوگه با آنزیم HRP به چاهکها اضافه می شوند که این 4T کنژوگه (HRP4-T (با 4T موجود در نمونه در اتصال به آنتی بادیهاي
کوت شده در چاهکها رقابت می کند، بنابراین هر چه مقدار 4T در نمونه بیشتر باشد مقدار 4T کنژوگه کمتري به آنتی بادي هاي کوت شده متصل می گردد و بالعکس .
پس از شستشو محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است به داخل چاهکها ریخته شده و انکوبه می گردد که بعد از انکوباسیون رنگ آبی
پدید آمده به صورت معکوس با غلظت 4T موجود در نمونه ها متناسب است. براي جلوگیري از فعالیت بیش از اندازه و نامناسب آنزیم محلول متوقف کننده افزوده می
گردد که فعالیت آنزیم را متوقف کرده و رنگ آبی را به زرد تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد 4T) Plate Coated 4T-Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme 4T (: یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3) اسی بافر (buffer Assay (: یک ویال حاوي 6 میلی لیتر (آماده مصرف) .
4) سري استانداردها (Set Standards (: 6 ویال استاندارد شامل غلظتهاي ،0 2 ، 4 ، 8 ، 12 , 20 dl/g از 4T) استاندارد صفر حاوي 1 میلی لیتر و سایر استانداردها
حاوي 0/5 میلی لیتر می باشند) .
5) سرم کنترل : یک ویال حاوي 0/5 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
6) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X 20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف مقدار لازم از
محلول شستشوي غلیظ را به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق کنید .
7) محلول رنگزاي یک مرحله اي(Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
8) محلول متوقف کنندة (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي ,25 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان:
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت تعبیه شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .

3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند، جهت
احتیاط بهتر است هر پرسنلی که با کیت کار می کند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزد .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط -8 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد.
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(ماکزیمم 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود (در ضمن باید از thaw-Freez نمودن نمونه پرهیز شود) .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است بمحض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حد اکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7) به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و باقی چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید.
2) 25 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید . پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید ، سپس 50 میکرولیتر اسی بافر
(buffer Assay (و در پی آن 50 میکرولیتر آنزیم کنژوگه را در داخل چاهک ها ریخته و براي مدت 15 ثانیه پلیت را تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط
شوند و آنگاه درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 1 ساعت در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه سانتی گراد) و در تاریکی انکوبه
نمایید .
3) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهک ها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بزنید تا قطرات اضافی خارج شوند .
4) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate – Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید و چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه
نمایید .
5) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر
چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید ( توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .

1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل
نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .

استانداردها
جذب نوري (dl/g(
0 2/72
2 1/35
4 0/82
8 0/41
12 0/21
20 0/12

توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید.
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال 4T در سرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود
را بدست آورد :

میانگین محدوده طبیعی dl/g محدوده طبیعی dl/g
4/7-12/5 8/6

g/dl × 12.87 = nmol/L
nmol/L × 0.078 = g/dl
شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر ومنهاي سه برابر انحراف معیار (SD (حد اقل غلظت 4T قابل تشخیص در این کیت 0/4dl/g می باشد.
2) دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا-اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در سري آزمایش هاي
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف4T انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :

جدول شماره1 (اینترا- اسی) :
1 24 3/6 0/18 5 نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (dl/µg (SD %CV
5/8 0/55 9/5 24 2
3/6 0/58 16 24 3
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (dl/µg (SD %CV
5/5 0/21 3/8 10 1
7/6 0/76 9/9 10 2
4/4 0/68 15/3 10 3
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .

3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از 4T به 4 سرم با غلظتهاي مشخص 4T افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدار 4T موجود در سرم نمونه
(µg/dl)
مقدار افزوده شده 4T
(µg/dl)
مقدار مورد انتظار
(µg/dl)
مقدار بدست آمده
(µg/dl)
ریکاوري
(%)
107 2/4 2/25 2 2/5 1
98 5/1 5/2 8 2/5 1
107 12 11/2 20 2/5 1
93 2/8 3 2 4 2
105 6/3 6 8 4 2
100 12 12 20 4 2
93 4/2 4/5 2 7 3
95 7/1 7/5 8 7 3
103 13/9 13/5 20 7 3
109 7/1 6/5 2 11 4
95 9 9/5 8 11 4
106 16/5 15/5 20 11 4
۴) خطی بودن آزمایش :
شده است . با کمک استاندارد صفر ، رقتهاي متوالی از 4 نمونه سرم با غلظت مشخص از 4T تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
نمونه
مقدار 4T موجود در سرم رقیق نشده
(µg/dl)
ریکاوري ( % )
2 12 94 91 109 — 1 8/5 95 106 91 — رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16
91 92 90 96 21 3
107 109 94 90 28 4

٥) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهایی با غلظتهاي مختلف (3T (Triiodothyronine – 5 ,’3 3, -) 3rT (Triiodothyronine’ 5 ,’3 3,
acid acetic Triiodothyro – 5 ,’3 3, acid Triiodothyropropionic 5 ,’3 3, و Diiodothyronine – 5 3, جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با 4T بررسی شد
که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
جدول اختصاصیت (واکنش متقاطع) :
غلظت آنالیت
(nmol/L)
غلظت ظاهري 4T
(g/dl)
<0/4 1000 3, 5 – Diiodothyronine
<0/4 100 3, 3’, 5 – Triiodothyronine (T3)
3, 3’, 5’ – Triiodothyronine
(rT3)
<0/4 100
3, 3’, 5 – Triiodothyro acetic
acid
<0/4 100
3, 3’, 5 – Triiodothyropropionic
acid
<0/4 100
References:
Liewendahl K: Assessment of thyroid status by laboratory methods: development and perspectives. Scand J Clin Invest 50
(Suppl 201) : 83-92, 1990. Cavalieri RR, Rapoport B: “Impaired peripheral conversion of Thyroxine to Triiodothyronine.” Ann Rev Med 28:57-65,1977.
Spector DA et al: “Thyroid function and metabolic state in chronic renal failure.” Ann Int Med 85:724-730,
Burr WA et al: “Serum triiodothyronine and reverse triiodothyronine concentrations after surgical operation.” Lancet II:1277- 1279,1975

وش انجام آزمایش 4Tبصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي جهت تست 4T
سرم کنترل – 25 میکرولیتر – استانداردها 25 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 25 میکرولیتر
اسی بافر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت
بپوشانید. 60 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار
چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)قرائت کنید .