کیت سنجش هورمون T3 به روش الایزا

کیت سنجش هورمون T3 به روش الایزا
مقدمه :
T3 همانند T4 در غده تیروئید ساخته می شود ، البته فقط 20 %T3 موجود در خون در تیروئید ساخته می شود و 80 %دیگر از تجزیه T4 در بافتها ساخته می شود. قابل
ذکر است که مقدار آزاد این هورمون نیز در خون بسیار کم بوده (3/0 (%که می تواند به داخل بافتها وارد شده و اثر خود را اعمال کند و بقیه این هورمون بصورت متصل با
همچنین رشد و تمایز اعضاء جنسی نقش اساسی دارد. اندازه گیري T3 Total یک فاکتور مهم در بررسی اختلالات تیروئید بخصوص در هیپرتیروئیدیسم بشمار می رود. پروتئینهاست که اصلی ترین این پروتئینها، تیروکسین بایندینگ گلوبولین (TBG (و آلبومین می باشند، T3 در سوخت و ساز سلولی بسیار موثر بوده و در رشد بدن و
تقریباً در 5 تا 10 %افراد مبتلا به هیپرتیروئیدیسم تیتر T3 فاکتور بسیار ارزشمندي در بررسی عملکرد تیروئید نسبت به سایر آزمایشات می باشد. کیت حاضر قابلیت اندازه
گیري و تیتراسیون هورمون T3 را با اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
کیت T3 حاضر به روش رقابتی و به کمک آنتی بادي مونوکلونال طراحی گردیده است . در این روش چاهکها توسط آنتی بادي منوکلونال که بر علیه مولکول T3 می باشد
پوشش داده می شوند (Coating . (استانداردها و نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شوند و پس ازانکوباسیون، T3 که متصل به آنزیم
HRP است به چاهکها اضافه می شود که این T3 کنژوگه (HRP-T3 (با T3 نمونه ها در اتصال به آنتی بادیهاي کوت شده در چاهکها رقابت می کند، بنابراین هر چه
مقدار T3 در نمونه بیشتر باشد مقدار T3 کنژوگه کمتري به آنتی بادي هاي کوت شده متصل می گردد و بالعکس . پس از شستشو ، محلول رنگزا که محتوي هیدروژن
پراکسید (H2O2 (و کروموژن است به داخل چاهکها ریخته شده و انکوبه می گردد که بعد از انکوباسیون رنگ آبی پدید آمده به صورت معکوس با غلظت T3 موجود در
نمونه ها متناسب است، براي جلوگیري از فعالیت بیش از اندازه و نامناسب آنزیم ، محلول متوقف کننده افزوده می گردد که فعالیت آنزیم را مختل کرده و رنگ آبی را به زرد
تبدیل می نماید که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1 (پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد T3) Plate Coated T3-Anti. (
2 (محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme T3 : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر محلول حاوي T3 کنژوگه شده با آنزیم HRP) آماده مصرف) .
3 (سري استاندارد (Set Standard : (6 ویال استاندارد شامل غلظتهاي صفر، 5/0 , 1 , 5/2 , 5 و 10 ml/ng از T3) هر ویال استاندارد حاوي 1 میلی لیتر می باشد) .
4 (محلول اسی بافر (Buffer Assay : (یک ویال حاوي 6 میلی لیتر.
5 (سرم کنترل : یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي بر چسب ویال .
6 (محلول شستشو: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (20X (جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف مقدار لازم از محلول شستشوي غلیظ را به
نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق کنید .
7 (محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen :(یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
8 (محلول متوقف کننده (Solution Stop : (یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9 (برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1 (دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس).
2 (سمپلر هاي 50 و 100 میکرو لیتر دقیق .
3 (آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1 (محتویات این کیت فقط براي مصرف در همین کیت می باشد .
2 (از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خوداري نمایید .
3 (کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ، جهت احتیاط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .

شرایط نگهداري :
1 (کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداري نمایید .
2 (چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3 (پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4 (محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 20/1 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه می تواند براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت طولانی تر (حداکثر
تا 30 روز ) در دماي 20 -درجه سانتی گراد نگهداري شود . در ضمن باید از thaw – Freeze نمودن نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1 (قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2 (بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3 (از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4 (پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5 (براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6 (از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7 (به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1 (تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2 (50 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید، سپس 50 میکرولیترازمحلول اسی بافر
(buffer Assay (را به داخل هر چاهک بریزید .
3 (پلیت را براي مدت 15 ثانیه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و سپس درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به
مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
4 (50 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه را به هر چاهک اضافه نمایید .
5 (پلیت را براي مدت 15 ثانیه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و سپس درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به
مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
6 (محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو میتوان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود
که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ، در هر دفعه شستشوحدود 300 میکرولیتر محلول
شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي
یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
7 (100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
8 (چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
9 (با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول توقف دهنده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک از
دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه میشود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد).
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .

1 (جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید .
2 (با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
منحنی بدست آید .
3 (میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .

جذب نوري استانداردها (ml/ng(
0 2.4
0.5 1.55
1 1.2
2.5 0.7
5 0.4
10 0.2

توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .

مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال T3 در سرم افراد طبیعی که به توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده بقرار زیر می باشد ولی پیشنهاد میگردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود را
بدست آورد :

محدوده طبیعی
ng/ml
ng/ml طبیعی محدوده

0/6 – 2/1 1/4

ng/ml × 100 = ng/dl
ng/ml × 1.536 = nmol/L
nmol/L × 0.651 = ng/ml
شاخصهاي اجرایی :
1 (حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و منهاي سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت T3 قابل تشخیص در این کیت 1/0 ml/ng می باشد .
2 (دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشات مختلف) با
استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلفT3 انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :

جدول شماره1) اینترا- اسی) :
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست
(ng/ml)
CV% SD
3/8 0/02 0/53 24 1
3/1 0/05 1/63 24 2
3/1 0/17 5/45 24 3
جدول شماره 2) اینتر- اسی) :
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست
(ng/ml)
CV% SD
8/8 0/05 0/57 10 1
3/6 0/06 1/66 10 2
4/9 0/28 5/65 10 3
3 (اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهائی با غلظتهاي مختلف thyroxine-L ، Diiodothyronine, Diiodothyrosine , Phenylbutazone ,Iodothyrosine و
Salicylate Sodium جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با T3 بررسی شد که نتایج آن در جدول زیر آمده است:
غلظت آنالیت
(µg/ml)
غلظت ظاهري T3
(ng/ml)
<0/1 10 Iodothyrosine
<0/1 10 Phenylbutazone
<0/1 10 Sodium Salicylate
<0/1 10 Diiodothyronine
<0/1 10 Diiodothyrosine
<0/1 10 L-thyroxine
۴ (ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از T3 به 4 نمونه سرم با غلظتهاي مشخص T3 افزوده شده و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول آمده است .
ریکاوري
( %)
مقدار بدست آمده
(ng/ml)
مقدار مورد انتظار
(ng/ml)
مقدار افزوده شده T3
(ng/ml)
مقدار T3 موجود در نمونه
(ng/ml)
نمونه
100 0/8 0/8 1 0/6 1
93 2/6 2/8 5 0/6 1
96 5/1 5/3 10 0/6 1
107 1/4 1/3 1 1/6 2
94 3/1 3/3 5 1/6 2
109 6/3 5/8 10 1/6 2
91 1/55 1/7 1 2/4 3
111 4/1 3/7 5 2/4 3
92 5/7 6/2 10 2/4 3
108 2/6 2/4 1 3/8 4
93 4/1 4/4 5 3/8 4
94 6/5 6/9 10 3/8 4

۵ (خطی بودن آزمایش :
با استفاده از استاندارد صفر، رقتهاي متوالی از 4 نمونه سرم با غلظت مشخص از T3 تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
شده است .
نمونه
مقدار T3 موجود در سرم رقیق نشده
( ng/ml)
ریکاوري ( % )
1/16 رقت 1/8 رقت 1/4 رقت 1/2 رقت – 108 97 103 1/4 1
101 109 95 92 2/9 2
87 89 111 100 4/8 3
111 109 105 100 7/8 4

References :
Barker, S.B., “Determination of Protein Bound Iodine.” Journal of Biological Chemistry, 173, 175, (1948).
Chopra, I.J., Solomon, D.H., and Ho, R.S., “A Radioimmunoassay of Triiodothyronine,” J. Clinical EndocrinoL, 33, 865 (1971).
Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U., “Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests.” Clinical Chemistry, 21, 3660
(1975).
Sterling, L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, P. 19-51 (1975).
روش انجام آزمایش T3 بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي جهت تست T3
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
اسی بافر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب
مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
آنزیم کنژوگه 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر 50 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب
مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی
کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را با طول موج 450 نانومتر(و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .