کیت سنجش 4HE به روش الایزا

کیت سنجش 4HE به روش الایزا
حیطه کاربرد : کیت الایزاي 4HE پیشتاز طب ، براي سنجش کمی 4HE در سرم انسان طراحی شده است . این کیت به عنوان یک ابزار کمک تشخیصی و پیگیري
اثربخشی درمان در بیماران سرطان تخمدان به کار می رود . محتوي این کیت تنها براي تشخیص آزمایشگاهی می باشد .
مقدمه :
پروتئین اپیدیدم انسانی 4(4HE(براي اولین بار در اپی تلیوم دستگاه تناسلی شناسایی شد که به عنوان مهار کننده پروتئاز در فرایند بلوغ اسپرم ایفاي نقش می کند. بیان گلیکوپروتئین 4HE
به شدت محدود به بافتهاي نرمال اپی تلیوم دستگاه تناسلی و تنفسی می باشد. در حالی که 4HE ترشحی در مقادیر بالا در سرم بیماران مبتلا به سرطان تخمدان یافت می شود. بیان 4HE
در %93 کارسینوماي اپی تلیال سروزي و %100 کارسینوماي اپی تلیال آندومتر مشاهده می شود درحالی که تنها %50 کارسینوماي cell-Clear و%0 تومورهاي موسینی تخمدان مثبت هستند
. در سال 2011 تاییدیه FDA براي استفاده 4HE براي پیگیري درمان و نظارت بر عود بیماري در خانمهاي داراي توده سرطانی تخمدان صادر شد . مهمترین برتري 4HE این است که
برخلاف 125CA در اندومتریوز افزایش نمی یابد. این مساله باعث شد ترکیب 4HE و 125CA براي تعیین الگوریتم ریسک بدخیمی تخمدان با نام ROMA استفاده شود . در خانمهاي
یائسه غلظت 4HE سرمی به عنوان شاخص ارزشمندي براي تمایز کارسینوماي اپی تلیال تخمدان از توده هاي خوش خیم تخمدان محسوب می شود . بعلاوه ثابت شده است که ترکیب
4HE و 125CA می تواند کارآمدي 125CA را بهبود ببخشد. جالب توجه است که سطوح بالاي 4HE در بیش از نیمی از بیماران سرطان تخمدان که 125CA آنها افزایش نداشته است،
قابل سنجش است . بنابراین ترکیب این دو مارکر به مقدار اندکی حساسیت تشخیصی در سرطان تخمدان را بهبود می بخشد . مهمترین کاربرد ثابت شده 4HE در پیگیري پس از درمان
بیماران سرطان تخمدان و نظارت بر عود بیماري می باشد. در این مورد اندازه گیري 4HE مکمل سنجش 125CA و تسهیل کننده پیگیري درمان بیمارانی است که قبل از درمان 125CA
منفی یا پایین داشته اند . از این رو کیت الایزاي 4HE پیشتاز طب می تواند به عنوان یک ابزار کمک تشخیص و پیگیري اثربخشی درمان در بیماران سرطان تخمدان به
کاربرده شود .
اساس آزمایش :
اساس کیت کمی سنجش 4HE به روش الایزاي ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد . در این روش چاهکها توسط آنتی بادي مونوکلونال علیه یکی از
شاخصهاي آنتی ژنیک 4HE پوشش داده می شوند (Coating (. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور شده ، پس از انکوباسیون و شستشو ،
آنتی بادي ثانویه ضد 4HE متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه شده و انکوبه می گردد . مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت 4HE در نمونه ها
متناسب است . پس از شستشو ، محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده متناسب با
کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها است . با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) یک عدد پلیت داراي 96عدد چاهک پوشش داده شده با آنتی بادي منوکلونال ضد 4HE .
2) محلول اسی بافر ( Buffer Assay (: یک ویال 12 میلی لیتري حاوي محلول جهت رقیق کردن نمونه ها (آماده براي مصرف – آبی رنگ) .
3) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (: یک ویال 12 میلی لیتري حاوي محلول آنتی بادي ضد 4HE متصل شده به آنزیم پراکسیداز (آماده براي مصرف-
4) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال از استاندارد با غلظتهاي صفر ‚ 25‚ 100 ‚ 200 ‚ 400 و 800 L/pmol از 4HE) استاندارد صفر حاوي 2 میلی قرمز رنگ) .
لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) (آماده براي مصرف – بنفش رنگ) .

5) سرم کنترل پایین (Serum Control Low (: یک ویال 1 میلی لیتري سرم انسانی حاوي مقدار مشخص 4HE رقیق شده در محلول بافري داراي پروتئین به عنوان
پایدار کننده و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ (آماده براي مصرف – زرد رنگ) . غلظت دقیق کنترل روي ویال ذکر شده است .
6) سرم کنترل بالا (Serum Control High (: یک ویال 1 میلی لیتري سرم انسانی حاوي مقدار مشخص 4HE رقیق شده در محلول بافري داراي پروتئین به عنوان
پایدار کننده و %0/05 کاتن به عنوان ماده محافظ (آماده براي مصرف – قرمز رنگ) . غلظت دقیق کنترل روي ویال ذکر شده است .
7) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال 12 میلی لیتري حاوي تترا متیل بنزیدین و آب اکسیژنه (آماده براي مصرف- بی رنگ)
8) محلول شستشو (Buffer Wash (: یک ویال 50 میلی لیتري حاوي محلول شستشوي غلیظ (x20 (داراي محلول بافر فسفات و %0/05 توئین 20 ، جهت تهیه محلول
شستشوي آماده مصرف ، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت20 1/ رقیق نمایید .
9) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال 12 میلی لیتري حاوي اسید کلریدریک 1 نرمال .
10) یک عدد برچسب مخصوص پلیت .
11) دستورالعمل مصرف .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر داراي فیلتر 450 نانومتر (در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)
2) سمپلر هاي دقیق و کالیبره 20 و 100 میکرولیتري و سر سمپلرهاي مخصوص یکبار مصرف
3) کاغذ نمگیر
4) آب مقطر
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت تنها براي مصرف در همین کیت قابل استفاده هستند .
2) تمامی محتویات کیت تنها براي استفاده تشخیصی در آزمایشگاه می باشند .
3) تنها پرسنل آموزش دیده بایستی از این تست استفاده نمایند .
4) این کیت صرفا جهت اندازه گیري 4HE در سرم انسانی طراحی و ساخته شده است .
5) از مخلوط کردن محتویات کیت ها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
6) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg وآنتی بادیهاي HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند . جهت احتیاط بهتر
است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند و از وسایل ایمنی لازم در آزمایشگاه استفاده نمایند .
7) نمونه بیماران، استانداردها ، کنترل ها و چاهک هاي استفاده شده، باید به عنوان پسماندهاي عفونی در نظر گرفته شوند. تمام محلول هاي واکنش گر و معرف ها باید
مطابق با مقررات ملی دفع پسماندهاي عفونی امحاء شوند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .

4) ممکن است در محلول شستشوي غلیظ کریستال تشکیل شود که این امر مشکلی را ایجاد نمی نماید . قبل از تهیه محلول شستشوي کار ، براي حل شدن کریستالها ، ویال را
در 37 درجه سانتی گراد قرار دهید . محلول شستشو را به نسبت 1/20 به میزان مورد نیاز با آب مقطر رقیق نمایید ؛ این محلول (آماده مصرف) به مدت یک هفته در شرایط
-8 2 درجه سانتیگراد قابل نگهداري و مصرف می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه:
سرم را می توان پس از جدا نمودن از لخته خون استفاده نمود . نمونه می تواند براي مدت دو روز در دماي -8 2 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري بیش از
دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد (در ضمن باید از thaw – Freeze نمودن نمونه پرهیز شود) . از نمونه هاي مشکوك به آلودگی میکروبی جهت
انجام آزمایش استفاده نشود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها باید به درجه حرارت اتاق برسند . پلیت را بعد از رسیدن به دماي محیط از کیسه مخصوص آن خارج کرده و چاهکهاي
مورد نیاز را بردارید .
2) به محض شروع آزمایش کلیه مراحل باید بدون توقف انجام پذیرند . از خشک شدن چاهکها در بین مراحل انکوباسیون پرهیز شود .
3) حتما از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده شود .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده ، جذب نوري چاهک ها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهک ها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهک ها تخلیه شوند .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب ، زمان انکوباسیون مناسب می باشد . بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب آنها را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیق تر می شود .
مراحل انجام آزمایش :
2) 20 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین معنی 1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب کرده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید . استانداردها، سرم هاي کنترل و نمونه ها را طبق دستور
زیر در چاهک ها بریزید ؛
شش چاهک اول براي استانداردهاي مختلف ، دو چاهک بعدي به ترتیب براي سرم کنترل پایین و بالا و سایر چاهک ها را براي نمونه ها استفاده کنید.
3) 100 میکرولیتر از محلول اسی بافر (Buffer Assay (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن بخوبی مخلوط شوند
درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
4) محتویات چاهک ها را خالی کرده و چاهک ها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید . براي شستشو چنانچه دستگاه واشر اتوماتیک در دسترس نباشد می توان از
سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد . در هر
دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو ، چاهک ها را
در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند .

5) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (آماده مصرف را به داخل چاهک ها بریزید ؛ پس از پوشاندن چاهک ها توسط برچسب مخصوص پلیت،
چاهکها را به مدت 30 دقیقه در دماي اتاق (22-28 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
6) محتویات چاهک ها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید ( همانند بند 4 ) .
7) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen ( به هر چاهک اضافه نمایید ؛ چاهک ها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی قرار دهید .
8) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ، واکنش هاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري هر چاهک از
دستگاه الایزا ریدر با فیلتر nm 450 استفاده نموده و جذب نوري چاهک ها را قرائت نمائید . توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد .
ارزشیابی آزمایش :
– جذب نوري استاندارد صفر و 800 L/pmol به ترتیب کمتر از 0/1 و بیشتر از 1/6 قابل قبول است . این آزمایش با داشتن شرایط زیر ارزشمند و قابل گزارش تلقی می گردد :
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 می توان استفاده نمود .
1) جذب نوري استانداردها، کنترل ها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450 و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانسnm 630 بخوانید .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري ( point to Point ( رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور عمودي
(Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل نمایید تا
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این منحنی بدست آید .
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید ، نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .
استانداردها
(pmol/L)
جذب نوري
(450/630nm)
0 <0.1
800 >1.6

استانداردها
(pmol/L)
جذب نوري
(450/630nm)
0 0.019
25 0.19
100 0.64
200 1.12
400 1.77
800 2.50

جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار:
مقادیر نرمال درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده بقرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود را بدست
آورد :
مقادیر سرمی 4HE در 238 خانم سالم اندازه گیري شد . میانگین داده ها L/pmol 49.7) حدود اطمینان 95%
47.2-52.2 ) با انحراف معیار L/pmol 19.7 محاسبه شد . در این مطالعه %98 افراد مقدار 4HE کمتر از L/pmol 120 داشتند .
محدودیت هاي روش اندازه گیري :
هر چند طراحی این کیت به گونه اي است که از تاثیر عوامل مداخله گر تا حد امکان جلوگیري شود اما به ندرت امکان دارد بعضی عوامل موجود در نمونه سرم ، از جمله
آنتی بادي هاي هتروفیلیک ، برخی داروها ، اتوآنتی بادي ها و نظایر اینها بر نتیجه آزمایش اثر بگذارند. بنابر این بهتر است تفسیر نتیجه آزمایش با در نظر گرفتن نتایج
معاینات بالینی، یافته هاي تشخیصی دیگر و شرح حال بیمار انجام گیرد .
شاخصهاي اجرایی:
1) مطالعه مقایسه ایی :
کیت سنجش 4HE شرکت پیشتاز طب با کیت تجاري مربوطه مقایسه شد . نمونه هاي سرم 127 بیمار با تشخیص قطعی سرطان تخمدان خوش خیم و بدخیم مراجعه
کننده به یکی از بیمارستانهاي ریفرال انکولوژي براي تستهاي مقایسه ایی استفاده شدند . نتایج تستهاي مقایسه ایی بروي نمونه هاي ذکر شده بیانگر همبستگی %98 بین
کیت پیشتاز طب و کیت تجاري معتبر بود .

2) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر مبناي جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (مرز شاهد (LoB (در این کیت L/pmol 0.26 می باشد . بر اساس جذب نوري نمونه با غلظت پایین
آنالیت (L/pmol 5 (و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت قابل تشخیص 4HE در این کیت L/pmol 5.46 می باشد .
3) دقت آزمایش:
جهت بررسی تکرار پذیري کیت ، آزمونهاي دقت درون سنجی (در یک کیت) و میان سنجی (بین چند کیت از یک سري ساخت) بوسیله سه نمونه سرمی با غلظتهاي
متفاوت 4HE انجام شد که نتایج آن در جداول زیر آمده است .
– آزمون دقت درون سنجی (assay -Intra (:
تعداد دفعات
تکرار تست
میانگین
(pmol/L)
SD
(pmol/L) CV %
نمونه 1 20 52.37 1.96 3.74
نمونه 2 20 341.46 7.63 2.23
نمونه 3 20 608.04 20.84 3.43
– آزمون دقت میان سنجی (assay -Inter (:
تعداد دفعات
تکرار تست
میانگین
(pmol/L)
SD
(pmol/L) CV %
44.63 3.31 7.42 نمونه 1 20
362.13 14.40 3.98 نمونه 2 20
650.10 32.73 5.03 نمونه 3 20

4) ریکاوري آزمایش :
مقادیر مشخصی از 4HE به سه نمونه سرم با مقادیر معلومی از 4HE افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
* جهت تست ریکاوري از استانداردهاي کیت استفاده نشود .
جدول ریکاوري :
مقدار 4HE موجود نمونه
در سرم (L/pmol(
مقدار 4HE افزوده شده
(pmol/L)
مقدار مورد انتظار
(pmol/L)
مقدار بدست آمده
(pmol/L) (%) ریکاوري
91.82 94.55 102.98 146.05 59.90 1
92.84 185.10 199.38 338.85 59.90 1
103.20 357.59 346.50 633.10 59.90 1
90.60 188.02 207.53 146.05 269.00 2
96.82 294.25 303.93 338.85 269.00 2
95.80 432.10 451.05 633.10 269.00 2
90.16 279.00 309.45 146.05 472.85 3
85.62 347.49 405.85 338.85 472.85 3
96.23 532.15 552.98 633.10 472.85 3
5) خطی بودن آزمایش :
براي تایید خطی بودن تست ، رقتهاي سریالی از 3 نمونه سرم با غظت مشخص از 4HE تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت و درصد ریکاوري محاسبه شد که در
جدول زیر نتایج آن آورده شده است .
نمونه
مقدار 4HE موجود در
سرم رقیق نشده
(pmol/L)
ریکاوري (%)
رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16
147.2 1 95.70 98.76 107.01 95.65
313.47 2 91.32 97.54 92.27 101.23
610.17 3 97.58 101.23 90.68 106.08

6) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش 4HE جهت سرم هاي با غلظت بسیار بالا از این آنالیت ( تا L/pmol 30000 ( صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
7) واکنش متقاطع :
واکنش متقاطعی با آنتی ژن هاي 15-3CA 19.9,CA ,PSA ,AFP ,CEA و 125CA مشاهده نشد .
References:
Kumarasamy C, Madhav MR, Sabarimurugan S, Lakhotiya K. et al. Diagnostic and prognostic role of HE4 expression in multiple
carcinomas, Medicine: 2019;98(28):pe15336.
Kirchhoff C. Molecular characterization of epididymal proteins. Rev Reprod. 1998; 3:86-95.
Gentry-Maharaj A, Burnell M, Dilley J, et al. Serum HE4 and diagnosis of ovarian cancer in postmenopausal women with adnexal
masses. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(1):56.e1-56.e17.
Drapkin R, von Horsten HH, Lin Y, et al. Human epididymis protein 4 (HE4) is a secreted glycoprotein that is overexpressed by
serous and endometrioid ovarian carcinomas. Cancer Res. 2005;65(6):2162-2169.
Bingle L, Singleton V, Bingle CD. The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2), is expressed in normal tissues and
undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms. Oncogene. 2002; 21(17):2768-2773.
Hellström I, Raycraft J, Hayden-Ledbetter M, et al. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma. Cancer Res.
2003; 63(13):3695-3700.
Karlsen MA, Høgdall EV, Christensen IJ, et al. A novel diagnostic index combining HE4, CA125 and age may improve triage of
women with suspected ovarian cancer – An international multicenter study in women with an ovarian mass. Gynecol Oncol.
2015;138(3):640-6.
Huhtinen K, Suvitie P, Hiissa J, et al. Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic
cysts. Br J Cancer. 2009;100(8):1315-1319.
Andersen MR, Goff BA, Lowe KA, et al. Use of a Symptom Index, CA125, and HE4 to predict ovarian cancer. Gynecol Oncol.
2010;116(3):378-383.

وش انجام آزمایش 4HE به صورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد 4HE
سرم کنترل – 20 میکرولیتر – استانداردها 20 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 20 میکرولیتر
اسی بافر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهکها را با برچسب
مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید .طبق دستور
شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهکها
را خالی کنید. طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید.
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر ( ودرصورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس ) قرائت کنید .