کیت سنجش AFP به روش الایزا

کیت سنجش AFP به روش الایزا
AFP یک مولکول گلیکو پروتئینی با وزن مولکولی70000 دالتون است که از لحاظ ژنتیکی و ساختاري بسیار شبیه آلبومین انسانی است و هر دو پروتئین توسط ژنی در
کروموزوم 4 کد می شوند . AFP اصلی ترین پروتئین در جریان خون جنین بوده که ابتدا توسط کیسه زرده و سپس کبد سنتز می شود. غلظت AFP در خون جنین در
هفته نهم بارداري به حداکثر مقدار می رسد (3000000 نانو گرم درمیلی لیتر) و سپس به تدریج کاهش می یابد و در پایان بارداري به 20000 نانوگرم درمیلی لیتر خواهد
رسید. AFP از جنین به سرم مادر نیز وارد شده و بنابراین در دوران بارداري بویژه در سه ماهه سوم مقدار آن در سرم مادر افزایش می یابد . غلظت AFP در سرم مادر در
هفته 10 بارداري در حدود 5 نانوگرم در میلی لیتر می رسد و غلظت آن به میزان 15 درصد به ازاي هر هفته افزایش می یابد بطوري که در هفته 25 بارداري به حدود
180 نانوگرم در میلی لیتر خواهد رسید و مقدار آن پس از زایمان به حدود 2 نانوگرم در میلی لیتر می رسد . AFP به مایع آمنیوتیک نفوذ کرده و غلظت آن در حدود
15000 نانوگرم در میلی لیتر در هفته 16 بارداري می رسد . افزایش سطح سرمی در بیماریهاي مختلفی دیده می شود که میتوان به کارسینوم سلول کبدي ، برخی از
تومورهاي بیضه در بالغین اشاره کرد . علاوه براین در تومورهاي بدخیم کودکان نظیر هپاتو بلاستوم و نفروبلاستوم نیز افزایش می یابد . بطور غیر شایع به دنبال متاستاز
بدخیمی هاي دستگاه گوارش به کبد ممکن است افزایش مشاهده شود . امروزه اندازه گیري در مایع آمنیوتیک و سرم مادر بطور گسترده به منظور تشخیص قبل از تولد
نقص لوله هاي عصبی در جنین NTD مورد استفاده قرار می گیرد . کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون AFP را با اختصاصیت و حساسیت بالا دارا می باشد .
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد . در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی علیه یک شاخص آنتی ژنیک AFP
پوشش داده می شوند (Coating (. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور شده ، پس از انکوباسیون و شستشو ، آنتی بادي ثانویه ضد AFP
متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه شده و انکوبه می گردد . مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت AFP در نمونه ها متناسب است. پس از
شستشو، محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است به داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده متناسب با کمپلکس ایمنی
تشکیل شده در چاهکهاست. با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد AFP) Plate Coated AFP-Anti(.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي ml/ng 200 100, 50, 20, 5, 0, از AFP کالیبره شده در مقابل 1 WHO
st IS
(استاندارد صفر حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترل : دو ویال هر کدام حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت هاي مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول اسی بافر ( Buffer Assay ( یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen(: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
7) محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت
1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر و در صورت امکان 630 نانومتر .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ، جهت
احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاء یاد شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می
باشد.
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان طولانی تر
(حداکثر 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود . در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق رسانده و بخوبی تکان دهید تا کاملاً یکنواخت شوند .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7) به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول اسی بافر (Buffer Assay (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن بخوبی مخلوط
شوند درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
4) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشوئید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بزنید تا قطرات اضافی خارج شوند) .

5) 100 میکرو لیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه
سانتی گراد) انکوبه نمایید .
6) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 4) .
7) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (Substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
8) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
9) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (Solution Stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري از دستگاه
الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید ( توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید.
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل
نمایید تا منحنی بدست آید.
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید ، نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را
نشان خواهد داد

جذب نوري (ml/ng(ستانداردها

جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده بقرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال خود را
بدست آورد :
محدوده مرجع (%90حدود اطمینان) میانه محدوده مرجع برحسب واحد
2.2 0.2 – 8.5
هفته بارداري
غلظت AFP در سرم مادر ( Median(
(ng/ml)
15 28.6
16 33.8
17 40.3
18 45.5
19 53.3
20 57.2
21 67.6
0 0.03
5 0.20
20 0.71
50 1.44
100 2.12
200 2.66

شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حد اقل غلظت AFP قابل تشخیص در این کیت ml/ng 0/2 می باشد .
2) دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشات
مختلف ) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف AFP انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :
جدول شماره 1 (اینترا- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (ml/ng (SD %CV
5.8 0.11 1.9 24 1
4.7 1.55 33 24 2
4.6 6 130 24 3
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین (ml/ng (SD %CV
8.3 0.16 1.92 10 1
7.4 2.4 32.3 10 2
5.9 7.7 131 10 3
*هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
٣) ریکاوري آزمایش :
سه نمونه سرم با مقادیر معلومی از AFP به 4 سرم با غلظتهاي مشخص AFP افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
مقدارAFP موجود در سرم نمونه
(ng/ml)
مقدارافزوده شده AFP
(ng/ml)
مقدار مورد انتظار
(ng/ml)
مقدار بدست آمده
(ng/ml)
ریکاوري
(%)
93 3.8 4.1 5 3.2 1
95 11 11.6 20 3.2 1
95 49 51.6 100 3.2 1
109 12.5 11.5 5 18 2
95 18 19 20 18 2
95 56 59 100 18 2
104 35 33.5 5 62 3
95 39 41 20 62 3
105 85 81 100 62 3
94 81 86 5 167 4
108 101 93.5 20 167 4
94 125 133.5 100 167 4

٤) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 3 نمونه سرم با غظت مشخص از AFP تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
شده است.
٥) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش AFP جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا ml/µg 50 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References:
Johson p. j, ( 2002 ) Tumor markers in primary malignancies of the liver . In “ Tumor markers : physiology , pathology ,
technology and clinical applications “ . Dimandis E.P . AACC Press , Washington pp 269 – 276
Stenman, U.H and Alfathan H ( 2002 ) Marker for testicular cancer . In “ Tumor markers : physiology , pathology , technology and
clinical applications “ . Dimandis E.P . AACC Press , Washington pp 351 – 359
Christiansen M , Hogdall C.K , Andersen J.R and Norgardpedersen B ( 2001 ) Alpha – fetoprotein in plasma and serum of
healthy adults : preanalytical , aalytical and biological source of variation and construction of age – dependent reference intervals
. Scand. J. Invest. 61 : 205 – 216
Trape J , Botargues J.M , Porta F , Ricos C , Badal J . M , Salinas R . Sala M . and Roca A ( 2003 ) Reference change value for
alpha fetoprotein and its application in early detection of hepatocellular carcinoma in patients with hepatic disease . Clin. Chem.
49 ( 7 ) : 1209 – 1211
Nustad K , Paus E , Kierulf B , and Bormer O.P ( 1998 ) Specificity and affinity of 30 monoclonal antibodies against alpha
fetoprotein . Tumor Biol. 19 : 293 – 300
National Committee for Clinical Laboratory Standardization , Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices .
Approved Guideline EP 5 – A ( 1999 )
National Committee for Clinical Laboratory Standardization , National evaluation protocols for interference testing , Evaluation
protocol number 7 , Vol 6 , No 13 , August ( 1986 )

وش انجام آزمایش AFP بصورت شماتیک
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد AFP
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
اسی بافر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه
چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید. برچسب پلیت را
برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب
پلیت را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)
قرائت کنید .