کیت سنجش FSH به روش الایزا

کیت سنجش FSH به روش الایزا
مقدمه :
FSH هورمونی گلیکوپروتئینی است که از سلولهاي بازوفیلیک بخش قدامی غده هیپوفیز ترشح میشود. ترشح FSH توسط هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (GnRh (
تحریک میگردد. هورمونهاي استروئیدي گنادها مانند پروژسترون، استروژن و آندروژنها داراي اثرات فیدبک مثبت و منفی در ترشح FSH هستند. ترشح FSH داراي
یک الگوي نوسانی میباشد که در خانمها نسبت به آقایان با وضوح بیشتري قابل مشاهده است. در خانمها در دوره عادت ماهانه غلظت FSH داراي تغییراتی است بدین
ترتیب که در آغاز عادت ماهانه (فاز فولیکولار) FSH با اثر بر فولیکولهاي تخمدان باعث بلوغ آنها میگردد و با افزایش FSH در اواسط دوره عادت ماهانه عمل تخمک
گذاري (اوولاسیون) صورت میپذیرد. غلظت FSH در اوایل عادت ماهانه (فاز فولیکولار) بصورت خفیفی بالاتر از غلظت آن در اواخر دوره (فاز لوتئال) میباشد. در
خانمهاي یائسه به علت فقدان اثر مهاري هورمونهاي استروئیدي مترشحه از تخمدان مقدار FSH بصورت قابل ملاحظه اي افزایش مییابد. در آقایان هورمون FSH
باعث تحریک عمل اسپرماتوژنز میگردد. در اطفال تا قبل از سن بلوغ میزان غلظت FSH پایین میباشد. سنجش FSH در خانمها جهت بررسی و تشخیص اختلالات
عادت ماهانه ، آمنوره اولیه و ثانویه، هیرسوتیزم و ویریلیزم به کار میرود ضمناً FSH شاخص مناسبی جهت بررسی آغاز یائسگی در خانمهاست. سنجش FSH در آقایان
در موارد ناباروري ، هیپوگنادیسم، ژنیکوماستیا و برخی تومورها حائز اهمیت میباشد. در کودکان سنجش FSH جهت بررسی بلوغ جنسی زودرس و یا تاخیري بکار برده
می شود. کیت حاضر قابلیت اندازه گیري و تیتراسیون هورمون FSH را با اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا دارا میباشد .
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهائی علیه یک شاخص آنتی ژنیک زیر واحد
بتاي مولکول FSH پوشش داده میشوند (Coating (. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود، سپس آنتی بادي ثانویه ضد FSH
متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه می شود. مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت FSH در نمونه ها متناسب است. پس از شستشو محلول رنگزا
که حاوي هیدروژن پراکسید (2O2H (وکروموژن است، داخل چاهکها ریخته میشود که رنگ آبی پدید آمده با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها متناسب است، با
افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج 450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد FSH) Plate Coated FSH – Anti (.
2) محلول آنزیم کونژوگه (Conjugate Enzyme FSH (: یک ویال حاوي 12 میلیلیتر (آماده مصرف) .
3) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي صفر ، 5 ، 10 ، 25 ، 50 و 100 L/IU از FSH کالیبره شده در مقابل استاندارد
1
st
83/575 IRP WHO) استاندارد صفر حاوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترل : یک ویال حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول رنگزاي یک مرحلهاي (Substrate – Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول شستشو : یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف، مقدار مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت
1/20 رقیق نمایید .
7) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
8) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) .
2) سمپلر هاي 50 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .
نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3)کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HbsAg و آنتی بادیهاي ضد HCV وHIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل میباشند، جهت احتیاط
بهتر است کاربرانی که با کیت کار میکنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .

شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاي نوشته شده بر روي هر یک از آنها میباشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 8 – 2 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف می
باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه می تواند براي مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري شود ولی براي نگهداري بیش از
مدت دو روز باید از دماي -20 درجه سانتی گراد استفاده گردد. در ضمن باید از thaw – Freeze نمودن نمونه پرهیز شود .
توضیحات عمومی:
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید .
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت میباشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند .
6) در هنگام سمپلینگ تمام محلولها و نمونه ها را وسط چاهکها بریزید .
7) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب میباشد، بنابراین پیشنهاد میگردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي مورد نیاز را
آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید ، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر میشود .
8) به دلیل مشابه در بند 7 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 50 میکرولیتر از هر استاندارد ، سرم کنترل و نمونه را داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین
معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول آنزیم کنژوگه (conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن به
خوبی مخلوط شوند .
4) درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (28 – 22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
5) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید ، (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب
بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ، در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر
محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات
ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
6) 100 میکرولیتر محلول رنگزا (substrate – Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
7) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
8) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري از دستگاه
الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید ( توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
از هردستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري درطول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید .

2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي محور
عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید ، سپس نقاط بدست آمده را به یکدیگر وصل
نمایید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن را پیدا کنید ، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید بطوریکه این
خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید نقطه تلاقی این خط با محور افقی مقدار غلظت را نشان
خواهد داد .

جذب نوري (L/IU(استانداردها
0 0/028
5 0/255
10 0/460
25 1/050
50 1/882
100 2/778

توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال FSH درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال
محدوده طبیعی خود را بدست آورد :
میانگین محدوده طبیعی (L/IU(
(IU/L)
1/5 -9/7
8 -20
1/1 -7/2
5/2
14
4/1
خانمهاي نرمال قبل از یائسگی :
فاز فولیکولار
اواسط عادت ماهانه
فاز لوتئال
خانمهاي یائسه 70 -110 30
مردان زیر 60 سال 6 -10 2
شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت FSH قابل تشخیص در این کیت L/IU 1 میباشد .
2) دقت آزمایش :
آزمایشهاي اینترا – اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص از یک نمونه در سري آزمایشات
مختلف) با استفاده از 3 سرم با غلظتهاي مختلف hFSH انجام گردید که در جداول 1و 2 آمده است

جدول شماره1 (اینترا- اسی) :
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست
(IU/L)
SD
CV
(%)
2/9 0/2 7 24 1
4/2 0/8 19 24 2
6/6 4/1 62 24 3
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3 ) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از hFSH به 4 سرم با غلظتهاي مشخص hFSH افزوده شد و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول زیر آمده است :
جدول ریکاوري :
مقدار hFSH موجود در سرم نمونه
(IU/L)
مقدار افزوده شده hFSH
(IU/L)
مقدار مورد انتظار
(IU/L)
مقدار بدست آمده
(IU/L)
ریکاوري
(%)
103 3/6 3/5 5 2 1
93 12/5 13/5 25 2 1
104 58 56 100 2 1
108 6/5 6 5 7 2
94 15 16 25 7 2
95 51 53/5 100 7 2
95 9 9/5 5 14 3
108 21 19/5 25 14 3
96 55 57 100 14 3
96 24 25 5 45 4
109 38 35 25 45 4
95 69 72/5 100 45 4
٤) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی 4 نمونه سرم با غظت مشخص از hFSH تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر نتایج آن آورده
شده است .
میانگین نمونه تعداد دفعات تکرار تست
(IU/L)
SD
CV
(%)
3/8 0/3 7/9 10 1
5/5 1/0 18/2 10 2
9/5 5/8 61 10 3

جدول خطی بودن :
مقدار hFSH موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(IU/L)
ریکاوري (%)
رقت
1/2
رقت
1/4
رقت
1/8
1/16 رقت
100 97 98 97 20 1
97 99 103 96 39 2
99 97 101 95 47 3
97 96 97 100 80 4
٥) اختصاصیت آزمایش :
اختصاصیت این آزمایش به کمک سرمهایی با غلظتهاي مختلف hLH , hTSH و hCG جهت بررسی واکنشهاي متقاطع با hFSH بررسی شد که نتایج آن در جدول
زیر آمده است :
جدول اختصاصیت (واکنش متقاطع) :
آنالیت غلظت غلظت ظاهري (L/IU (hFSH
hLH
(IU/L)
500
250
100
50
<١
hTSH
(mIU/L)
500
250
100
50
< 1
hCG
(IU/L)
200000
100000
10000
1000
< 1
٦) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش hFSH جهت سرمهائی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا L/IU 2500 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References :
Wide L.Human pituitary gonadotropins: Hormone assays and their clinical application, pp 87-140 Ed J A Loraine, E T Bell,
Churchill Livingstone, Edinburgh, London and New York 1976.

روش انجام آزمایش FSH بصورت شماتیک
چاهک هاي کوت شده با آنتی بادي ضد FSH
سرم کنترل – 50 میکرولیتر – استانداردها 50 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 50 میکرولیتر
آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را با ملایمت به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند و سپس دهانه چاهک ها را با
برچسب مخصوص پلیت بپوشانید . 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت را برداشته و محتویات چاهک ها
را خالی کنید . طبق دستور شستشو 5 بار چاهک ها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید .
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهک ها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس) قرائت کنید .