PSA به روش الایزا

PSA به روش الایزا
مقدمه :
آنتی ژن اختصاصی پروستات (PSA (جزئی از خانواده آنزیم کالیکرئین با وزن ملکولی حدود 30 کیلو دالتون است که داراي فعالیت آنزیمی مشابه کیموتریپسین
می باشد. این گلیکو پروتئین منومر در اپی تلیوم غده پروستات تولید و به طور طبیعی به داخل مایع سمینال ترشح شده و عملکردآن تجزیه پروتئینهاي
نمایانگر یک پرو آنزیم یا شکل غیر فعال از نظر آنزیمی است و نوع دیگرکه بصورت یک کمپلکس بزرگ با مهار کننده هاي سرین پروتئازي سرم نظیر آلفا – وزیکولهاي سمینال و حل کردن لخته سمینال است. PSA در سرم به چندین شکل وجود دارد ، یک نوع با وزن مولکولی پایین (حدود 30 کیلو دالتون) که
1 – آنتی کیموتریپسین (ACT (مشاهده می شود. شکل غالب در اکثر افراد وزن مولکولی بالائی حدود -100 90 کیلو دالتون دارد که معادل وزن مولکولی
PSA و ACT است، نسبت این دو فرم در افراد تفاوت دارد، به ویژه در محدوده اي از PSA که براي تشخیص اولیه کانسر پروستات اهمیت دارد. مقادیر کم
PSA بطور طبیعی در جریان خون وجود دارد ولی افزایش آن نشانه اي از آسیب خوش خیم یا بدخیم پروستات است. امروزه اندازه گیري PSA به عنوان یک
روش در تشخیص کانسر پروستات و پیگیري پس از درمان و جراحی بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد. در کشورهاي پیشرفته سرطان پروستات بیشترین
تلفات را در بین سرطانها داشته و به عنوان دومین سرطان تشخیص داده شده به شمار می آید. اندازه گیري میزان PSA به تنهایی جهت تایید وجود کانسر
کافی نبوده زیرا در بزرگی خوش خیم پروستات (BPH (نیز دیده می شود و بهتر است به همراه سایر روشهاي تشخیصی به کار رود . بعد از برداشتن پروستات
(پروستکتومی) میزان PSA در حد صفر خواهد بود و مقادیر بالاتر از ml/ng 0/1 باید مورد توجه قرار گیرد و جهت عدم برداشت کامل غده و یا متاستاز
پیگیري شود . آنتی بادیهاي مورد استفاده در این کیت بطور دقیق جهت ارزیابی PSA آزاد و کمپلکس انتخاب شده است .
اساس آزمایش :
اساس این کیت به روش ساندویچ و با استفاده از آنتی بادیهاي مونوکلونال می باشد. در این روش چاهکها توسط آنتی بادیهایی علیه یک شاخص آنتی ژنیک
PSA پوشش داده می شوند (Coating(. نمونه بیماران با آنتی بادي پوشش داده شده در ته چاهکها مجاور می شود. پس از انکوباسیون و شستشو آنتی بادي
ثانویه ضد PSA متصل به آنزیم HRP به چاهکها اضافه شده و انکوبه می گردد که مقدار کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکها با غلظت PSA در نمونه
ها متناسب است، پس از شستشو محلول رنگزا که محتوي هیدروژن پراکسید (2O2H (و کروموژن است داخل چاهکها ریخته می شود که رنگ آبی پدید آمده
متناسب با کمپلکس ایمنی تشکیل شده در چاهکهاست. با افزودن محلول متوقف کننده رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که بهترین جذب نوري را در طول موج
450 نانومتر دارد .
محتویات کیت :
1) پلیت 96 خانه حاوي چاهکهاي پوشش داده شده با آنتی بادي ضد PSA) Plate Coated PSA-Anti (.
2) محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
3 ) سري استانداردها (Set Standards (: شامل 6 ویال استاندارد با غلظتهاي PSA ml/ng 50 25, 10, 4, 1, 0, کالیبره شده در مقابل استاندارد 96/670
IS st 1 WHO) استاندارد صفر محتوي 2 میلی لیتر و سایر استانداردها حاوي 1 میلی لیتر می باشند) .
4) سرم کنترلهاي بالا و پایین : دو ویال هر یک حاوي 1 میلی لیتر سرم کنترل با غلظت مشخص درج شده بر روي برچسب ویال .
5) محلول اسی بافر ( Buffer Assay ( : یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
6) محلول رنگزاي یک مرحله اي (Substrate-Chromogen (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر (آماده مصرف) .
7) محلول شستشو (Solution Wash (: یک ویال حاوي 50 میلی لیتر محلول شستشوي غلیظ (X20 (. جهت تهیه محلول شستشوي آماده مصرف ، مقدار
مورد نیاز را با آب مقطر به نسبت 1/20 رقیق نمایید .
8) محلول متوقف کننده (Solution Stop (: یک ویال حاوي 12 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نرمال .
9) برچسب مخصوص پلیت .
مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نمی باشند :
1) دستگاه الایزاریدر با طول موج 450 نانومتر و در صورت امکان 630 نانومتر .
2) سمپلر هاي 20 و 100 میکرولیتر دقیق .
3) آب مقطر .

نکات قابل ذکر براي مصرف کنندگان :
1) محتویات این کیت براي مصرف در همین کیت طراحی شده است .
2) از مخلوط کردن محتویات کیتها با شماره ساختهاي مختلف جداً خودداري نمایید .
3) کلیه مواد موجود در کیت که منشاء سرمی دارند از نظر وجود HBsAg و آنتی بادي هاي ضد HCV و HIV کنترل گردیده اند و فاقد این عوامل می باشند ،
جهت احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند .
شرایط نگهداري :
1) کیت را در یخچال بین دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد نگهداري نمایید .
2) چاهکها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداري نمایید .
3) پایداري محتویات کیت تا پایان مدت انقضاء نوشته شده بر روي هر یک از آنها می باشد .
4) محلول شستشوي آماده مصرف که به نسبت 1/20 با آب مقطر رقیق شده باشد به مدت یک هفته در شرایط 2-8 درجه سانتی گراد قابل نگهداري و مصرف
می باشد .
جمع آوري و آماده سازي نمونه :
سرم یا پلاسما را می توان پس از جدا نمودن از خون استفاده نمود ، نمونه را می توان به مدت دو روز در دماي 2 تا 8 درجه سانتی گراد و یا براي مدت زمان
طولانی تر (حداکثر 30 روز) در دماي -20 درجه سانتی گراد نگهداري نمود . در ضمن باید از thaw-Freeze نمودن نمونه پرهیز شود . پس از ماساژ
پروستات ، بیوپسی و یا جراحی Transurethral میزان PSA در سرم افزایش می یابد که با توجه به نیمه عمر 3 – 2 روزه آن بهتر است اندازه گیري PSA
حدودا˝ 2 – 3 هفته بعد انجام شود .
توضیحات عمومی :
1) قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق رسانده و بخوبی تکان دهید تا کاملاً یکنواخت شوند .
2) بهتر است به محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام پذیرند .
3) از نوك سمپلر یک بار مصرف براي هر نمونه استفاده کنید.
4) پس از افزودن محلول متوقف کننده جذب نوري چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می باشد .
5) براي کسب نتایج مطلوب باید شستشوي چاهکها بصورت کامل صورت گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شود .
6) از مهمترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب زمان انکوباسیون مناسب می باشد ، بنابراین پیشنهاد می گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلولهاي
مورد نیاز را آماده نموده و درب محلولهاي مورد نیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج دقیقتر می شود .
7) به دلیل مشابه در بند 6 بهتر است که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه بطول نیانجامد .
مراحل انجام آزمایش :
1) تعداد چاهکهاي مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداري پلیت قرار داده و درب آن را ببندید .
2) 20 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید ، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده
شود بدین معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوري آنها براي محاسبه نتایج استفاده کنید .
3) 100 میکرولیتر از محلول اسی بافر (Buffer Assay (را به هر چاهک اضافه نموده و پلیت را به آرامی به مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات آن بخوبی
مخلوط شوند درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 22 درجه سانتی گراد) انکوبه
نمایید.
4) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (براي شستشو می توان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید
مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد ، در هر دفعه شستشو حدود
300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهاي عملیات شستشو چاهکها را در
5) 100 میکرو لیتر از محلول آنزیم کنژوگه (Conjugate Enzyme (را به هر چاهک اضافه نموده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت اتاق (-28 حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روي یک پارچه یا کاغذ نمگیر بزنید تا قطرات اضافی خارج شوند) .
22 درجه سانتی گراد) انکوبه نمایید .
6) محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوي آماده مصرف بشویید (همانند بند 4) .

7) 100میکرولیتر محلول رنگزا (substrate-Chromogen (به هر چاهک اضافه نمایید .
8) چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید .
9) با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده (solution stop (به هر چاهک ادامه واکنشهاي آنزیمی را متوقف نمایید . براي سنجش جذب نوري
از دستگاه الایزاریدر با فیلتر nm 450 استفاده نمایید (توصیه می شود از فیلتر nm 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد) .
محاسبه نتایج :
1) جذب نوري استانداردها و نمونه ها را به کمک دستگاه الایزاریدر در طول موج nm 450) و در صورت امکان در مقابل فیلتر رفرانس nm 630 (بخوانید . از هر دستگاه الایزاریدر با قابلیت سنجش جذب نوري در طول موج nm 450 میتوان استفاده نمود .
2) با استفاده از میانگین جذب نوري استانداردها و غلظت معلوم آنها نموداري (point to Point (رسم کنید به این صورت که جذب نوري استانداردها را روي
محور عمودي (Y (و غلظت آنها را روي محور افقی (X (برده و نقطه تلاقی غلظت و جذب نوري را براي هر استاندارد بدست آورید، سپس نقاط بدست آمده را
به یکدیگر وصل نمائید تا منحنی بدست آید .
3) میانگین جذب نوري براي هر نمونه را بدست آورده و روي محور عمودي جاي آن راپیدا کنید، سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل نمایید
بطوریکه این خط بر محور عمودي کاملاً عمود باشد و بعد از محل تلاقی خط و منحنی ، خطی عمود بر محور افقی وارد کنید، نقطه تلاقی این خط با محور
افقی مقدار غلظت را نشان خواهد داد .
توجه : جذبهاي نوري و منحنی مربوطه فقط به عنوان نمونه می باشد و هر آزمایشگاه در هر دفعه انجام آزمایش باید منحنی جدیدي رسم نماید .
مقادیر مورد انتظار :
مقادیر نرمال درسرم افراد طبیعی که توسط تستهاي مکرر به روش الایزا بدست آمده به قرار زیر می باشد ولی پیشنهاد می گردد که هر آزمایشگاه مقادیر نرمال
خود را بدست آورد :
محدوده طبیعی
Up to 4.0 ng/ml
شاخصهاي اجرایی :
1) حداقل مقدار قابل اندازه گیري :
بر اساس جذب نوري استاندارد صفر و سه برابر انحراف معیار (SD (حداقل غلظت PSA قابل تشخیص در این کیت ml/ng 0/1 می باشد .
2) دقت آزمایش :

آزمایشهاي اینترا- اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در یک سري آزمایش) و اینتر- اسی (همخوانی غلظت مشخص ازیک نمونه در سري
آزمایشات مختلف) با استفاده از 4 سرم با غلظتهاي مختلف PSA انجام گردید که در جداول 1 و 2 آمده است :

جدول شماره 1 (اینترا- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین ml/ng SD %CV
5/0 0/03 0/6 24 1
3/6 0/08 2/2 24 2
3/5 0/35 9/9 24 3
4/3 1/3 30 24 4
جدول شماره 2 (اینتر- اسی) :
نمونه تعداد دفعات تکرار تست میانگین ml/ng SD %CV
8/3 0/05 0/6 10 1
6/9 0/2 2/9 10 2
6/3 1/2 19/2 10 3
6/5 2/4 37 10 4
هر سري آزمایش بصورت Duplicate انجام شده است .
3) ریکاوري آزمایش :
مقادیر معلومی از PSA به 4 نمونه سرم با غلظتهاي مشخص PSA افزوده شده و ریکاوري آنها محاسبه گردید که نتایج آن در جدول صفحه بعد آمده است :
مقدارPSA موجود در سرم نمونه
(ng/ml)
مقدارافزوده شدهPSA
(ng/ml)
مقدار مورد انتظار
(ng/ml)
مقدار بدست آمده
(ng/ml)
ریکاوري
(%)
92 1/15 1/25 1 1/5 1
103 5/9 5/7 10 1/5 1
98 13 13/2 25 1/5 1
92 2/4 2/6 1 4/3 2
96 6/8 7/1 10 4/3 2
96 14/1 14/6 25 4/3 2
94 6/5 6/9 1 12/8 3
106 12/1 11/4 10 12/8 3
102 19/3 18/9 25 12/8 3
105 20 19/1 1 37/2 4
104 24/5 23/6 10 37/2 4
93 29 31/1 25 37/2 4

٤) خطی بودن آزمایش :
به کمک استاندارد صفر رقتهاي متوالی از 3 نمونه سرم با غلظت مشخص از PSA تهیه گردید و نتایج بر اساس ضریب رقت محاسبه شد که در جدول زیر
نتایج آن آورده شده است .
مقدار PSA موجود در سرم رقیق نشده نمونه
(ng/ml)
ریکاوري (%)
رقت 1/2 رقت 1/4 رقت 1/8 رقت 1/16 رقت 1/32
93 106 89 98 104 80 1
90 95 92 100 99 47 2
108 110 98 95 102 25 3
۵) اثر هوك (Effect Hook (:
آزمایش PSA جهت سرمهایی با غلظت بسیار بالا از این آنالیت (تا ml/µg 50 (صورت گرفت که پدیده هوك مشاهده نشد .
References:
Belanger A, van Harbeek H, et al. Molecular mass and carbohydrate structure of prostate specific antigen. Studies for
establishment of an international PSA. Prostate 1995; 27: 187-197 . Zhov A.M, Tewari P.C, card weu G.W. Multiple forms of PSA in serum; differences in immunorecognition by monoclonal
روش انجام آزمایش بصورت شماتیک . 2483 39:;1993 .Chem .Clin.assay polyclonal and
چاهکهاي کوت شده با آنتی بادي ضد PSA
سرم کنترل – 20 میکرولیتر – استانداردها 20 میکرولیتر – – محلولها استانداردها سرم کنترل نمونه
نمونه – – 20 میکرولیتر
اسی بافر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
پلیت را به ملایمت براي مدت 15 ثانیه تکان دهید تا محتویات چاهکها بخوبی مخلوط شوند ، سپس
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید 30. دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت
را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنید و طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول آنزیم کنژوگه 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
دهانه چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت بپوشانید. 30 دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنید . برچسب پلیت
را برداشته و محتویات چاهکها را خالی کنیدو طبق دستور شستشو 5 بار چاهکها را بشویید .
محلول رنگزا 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
15 دقیقه در دماي اتاق و در تاریکی انکوبه کنید.
محلول متوقف کننده 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر 100 میکرولیتر
جذب نوري چاهکها را در طول موج 450 نانومتر (و در صورت امکان 630 نانومتر به عنوان فیلتر رفرانس)
قرائت کنید .